Detailansicht
Characterization of FATZ-1 biomolecular condensates
with Z-disc proteins α-actinin-2 and ZASP
Izel Deniz Bilgi
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molecular Biology
Betreuer*in
Kristina Djinovic-Carugo
DOI
10.25365/thesis.79039
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-20198.69649.481783-0
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das intrinsisch ungeordnete und phasentrennende Z-disc Protein FATZ-1 hat multivalente Wechselwirkungen mit wichtigen Akteuren der Sarkomerreifung, einschließlich α-actinin-2 und ZASP. Zuvor wurde gezeigt, dass die essenziellen Z-disc Proteine α-actinin-2 und ZASP in den biomolekularen Kondensaten von FATZ-1 kolokalisieren und dass α-actinin-2 die Tröpfchenbildung in vitro verringert. Die Rolle von FATZ-1 bei der Organisation des Sarkomers und die Ergebnisse dieser spezifischen Interaktionen sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. In dieser Arbeit soll geklärt werden, wie die Phasentrennung von FATZ durch die Z-disc Proteine α-actinin-2 und ZASP beeinflusst wird, wobei der Schwerpunkt auf α-actinin-2 liegt. Wenn wir verstehen, wie die FATZ-1-Kondensate reguliert werden, könnte dies Aufschluss darüber geben, wie die für die Myofibrillogenese erforderliche Signalübertragung in der Z-disc zustande kommen. Wir verwendeten die etablierten Proteinkonstrukte Δ91-FATZ-1-GFP und α-actinin-2-Neeck. Mit Hilfe der statistischen Versuchsplanung beobachteten wir die Tröpfchengröße, die Anzahl und die von den Tröpfchen bedeckte Gesamtfläche mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Mit diesen Parametern zur Beschreibung des Kondensatverhaltens, erstellten wir angepasste Phasendiagramme von FATZ-1 in Abhängigkeit von der steigenden Konzentration des zweiten Z-disc Proteins. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass α-actinin-2 bei den verwendeten Konzentrationen die Tröpfchengröße, die Anzahl, oder die insgesamt bedeckte Fläche nicht in reproduzierbarer Weise verändert. Das Gleiche gilt für ZASP, obwohl die ZASP-Experimente nur vorläufig durchgeführt wurden. Interessanterweise bestätigen die hier berichteten Resultate nicht die Ergebnisse der zuvor durchgeführten Trübungsversuche mit FATZ-1 und α-actinin-2, bei denen die Tröpfchenbildung durch eine Erhöhung der α-actinin-2-Konzentration reduziert wurde. Daher wiederholten wir den Trübungsversuch mit den in den Mikroskopieexperimenten verwendeten Konstrukten. Die Ergebnisse der neuen Trübungsassays stimmen mit den Mikroskopieexperimenten überein: Es gibt keine signifikante Veränderung der Trübung und damit des Phasentrennverhaltens, obwohl ein allgemeiner Abwärtstrend beobachtet wurde. Dies deutet darauf hin, dass sich die etablierten Proteinkonstrukte bei der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung unterschiedlich verhalten und weitere systematische Experimente durchgeführt werden müssen. Insgesamt bietet diese Arbeit einen systematischen Ansatz zur Untersuchung von biomolekularen FATZ-1-Kondensaten im Zusammenhang mit kolokalisierenden Z-disc-Proteinen in vitro und hebt Verbindungen zwischen verschiedenen experimentellen Ergebnissen hervor, die zum Gesamtverständnis dieses komplexen Systems beitragen.
Abstract
(Englisch)
The intrinsically disordered and phase-separating Z-disc protein FATZ-1 has multivalent interactions with major players of sarcomere maturation, including α-actinin-2 and ZASP. It was previously shown that the essential Z-disc proteins α-actinin-2 and ZASP colocalize in the FATZ-1 biomolecular condensates and that α-actinin-2 diminishes droplet formation in vitro, suggesting that these interactions might be regulatory and involved in signaling in the Z-disc. However, FATZ-1’s role in sarcomere organization and the outcomes of its specific interactions is not yet fully understood. This thesis aims to elucidate how the phase-separation of FATZ is influenced by the colocalizing Z-disc proteins α-actinin-2 and ZASP, focusing on α-actinin-2. As myofibrillogenesis progresses, expression levels and local concentration of these proteins also change. Understanding how the FATZ-1 condensates are regulated might shed light on how the complex interactions and signaling required for myofibrillogenesis is achieved in the Z-disc. We used the established protein constructs Δ91-FATZ-1-GFP and α-actinin-2-Neeck. Taking the statistical Design of Experiment approach, we observed the droplet size, count and overall area covered by droplets at different protein concentrations using confocal microscopy. With these parameters to describe the condensate behavior, we created adapted phase-diagrams of FATZ-1 in function of the increasing concentration of the second Z-disc protein. Protein phase diagrams are important tools to map the complex landscape of phase-separating proteins and to pinpoint potentially important protein concentrations. Initial findings suggest that at the applied concentrations, α-actinin-2 does not change the droplet size, count or overall area covered in a coherent and reproducible manner. The same applies to ZASP, though ZASP experiments were done only in a preliminary way due to resource limitations. Interestingly, microscopy findings reported here do not support the outcome of the previously done turbidity assays with FATZ-1 and α-actinin-2, where droplet formation was reduced by increase of α-actinin-2 concentration. Thus, we repeated the turbidity assay with the protein constructs used in microscopy experiments. The results of the new turbidity assays agree with the microscopy experiments: there is no significant change in turbidity and thus phase-separation behavior, although an overall downwards trend was observed and turbidity at different concentrations changes in a different pace. This implies that the established protein constructs behave differently under liquid-liquid phase separation and more systematic experiments need to be done. Overall, this thesis provides a systematic approach to study FATZ-1 biomolecular condensates in context of colocalizing Z-disc proteins in vitro, highlighting links between different experimental outputs to contribute to the overall understanding of this elusive and complex system.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Z-Scheibe Biomolekulare Kondensate FATZ-1 α-actinin-2 ZASP Konfokalmikroskopie Flüssig-flüssig Phasentrennung
Schlagwörter
(Englisch)
Z-disc Biomolecular Condensates FATZ-1 α-actinin-2 ZASP Confocal Microscopy Liquid-Liquid Phase Separation
Autor*innen
Izel Deniz Bilgi
Haupttitel (Englisch)
Characterization of FATZ-1 biomolecular condensates
Hauptuntertitel (Englisch)
with Z-disc proteins α-actinin-2 and ZASP
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
85 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Kristina Djinovic-Carugo
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC17612364
Utheses ID
76991
Studienkennzahl
UA | 066 | 865 | |