Detailansicht
Development of an UnaG-based biosensor for sensitive bilirubin detection
Isabella Kraus
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Joint-Masterstudium Evolutionary Genomics and Systems Biology
Betreuer*in
David Berry
DOI
10.25365/thesis.79270
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-23545.67033.107794-5
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das menschliche Mikrobiom spielt eine entscheidende Rolle für die Physiologie des Wirts, insbesondere durch die Modulation von Immunreaktionen und zentralen Stoffwechselwegen. Während die mikrobielle Umwandlung von Bilirubin zu Urobilinogen kürzlich aufgeklärt wurde, bleibt die nachgeschaltete Reduktion von Urobilinogen zu Stercobilinogen mechanistisch bislang uncharakterisiert. Ziel dieser Arbeit war es, mikrobielle Enzymkandidaten zu identifizieren, die für diese Umwandlung verantwortlich sind, sowie ein skalierbares, fluoreszenzbasiertes Biosensorsystem zur Detektion von Bilirubin zu entwickeln. Dazu wurde ein umfassendes bioinformatisches Screening des Oligo Mouse Microbiome (OMM21)-Konsortiums durchgeführt, das BLASTP-Homologiesuchen gegen bekannte Bilirubin-Reduktasen (BilR), eine enzymatische Klassifikation über EC-Nummern sowie vergleichende Analysen zwischen verschiedenen Stämmen kombinierte. Die Studie identifizierte mehrere hochkonfidente BilR-Homologe, insbesondere in Flintibacter butyricus, Thomasclavelia ramosa und Escherichia coli, sowie eine eingegrenzte Auswahl an Oxidoreduktasen, die auf CH–CH-Gruppen wirken (EC 1.3.-.-), als plausible Kandidaten für Urobilinogen-Reduktasen (UroR). Parallel dazu wurde ein induzierbares, auf UnaG basierendes Fluoreszenz-Biosensorsystem in E. coli zur Bilirubin-Detektion etabliert. Das System zeigte in vitro eine hohe Spezifität und Sensitivität und konnte zuverlässig Bilirubinkonzentrationen im Nanomolarbereich detektieren. Die Validierung in biologischen Proben offenbarte jedoch Herausforderungen, darunter die Instabilität von Bilirubin, photochemische Zersetzung sowie störende Hintergrundfluoreszenz. Weitere Experimente identifizierten Lichtexposition, verlängerte Inkubationszeiten und das Vorhandensein von Antibiotika als Hauptfaktoren, die die Genauigkeit des Fluoreszenzsignals beeinträchtigten. Zudem führten Validierungsexperimente mit BilR-exprimierenden und β-Glucuronidase-defizienten Stämmen zu inkonsistenten Ergebnissen, möglicherweise aufgrund limitierter Substrataufnahme oder unvollständiger Metabolit-Umwandlung. Zusammenfassend liefert diese Arbeit (i) eine priorisierte Liste von UroR-Enzymkandidaten für weitere funktionelle Validierungen sowie (ii) ein validiertes und optimiertes UnaG-basiertes Biosensorsystem mit definierten anwendungsspezifischen Einschränkungen. Die Ergebnisse bilden eine Grundlage für zukünftige Untersuchungen zur Rolle des Mikrobioms im Bilirubin- und Urobilinogen-Stoffwechsel und eröffnen potenzielle Implikationen für die intestinale Immunhomöostase und die metabolische Gesundheit.
Abstract
(Englisch)
The gut microbiome plays a critical role in host physiology, particularly by modulating immune responses and key metabolic pathways. While the microbial conversion of bilirubin to urobilinogen has been recently elucidated, the downstream reduction of urobilinogen to stercobilinogen remains mechanistically uncharacterised. This thesis aimed to identify candidate microbial enzymes responsible for this transformation and develop a scalable fluorescence-based biosensor for bilirubin detection. A comprehensive bioinformatic screening of the Oligo Mouse Microbiome (OMM21) consortium was conducted, combining BLASTP homology searches against known bilirubin reductases (BilR), enzymatic classification via EC numbers, and cross-strain comparative analyses. The study identified multiple high-confidence BilR homologues, particularly in Flintibacter butyricus, Thomasclavelia ramosa, and Escherichia coli, as well as a refined set of CH–CH acting oxidoreductases (EC 1.3.-.-) as plausible urobilinogen reductase (UroR) candidates. Parallel laboratory work established an inducible UnaG-based fluorescence biosensor in E. coli for bilirubin detection. The system demonstrated high specificity and sensitivity in vitro, reliably detecting nanomolar bilirubin concentrations. However, validation in biological samples revealed challenges, including bilirubin instability, photodegradation, and interfering background fluorescence. Experiments identified light exposure, prolonged incubation, and antibiotic presence as major factors reducing fluorescence signal fidelity. Additionally, biological validation using BilR-expressing and β-glucuronidase-deficient strains yielded inconsistent results, possibly due to limited substrate uptake or incomplete metabolite conversion. In summary, this work provides (i) a prioritised set of candidate UroR enzymes for further functional validation and (ii) a validated, optimised UnaG-based biosensor system with defined operational limitations. The findings lay the groundwork for future investigations into the microbiome’s role in bilirubin and urobilinogen metabolism, with potential implications for gut immune homeostasis and metabolic health.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Wirt-Mikroben-Interaktionen Darmmikrobiom Bilirubin-Stoffwechsel Fluoreszenz-Biosensor Enzyme
Schlagwörter
(Englisch)
Gut microbiome Biomedicine Bilirubin metabolism Fluorescence biosensor Enzyme candidates Host–microbe interactions
Autor*innen
Isabella Kraus 
Haupttitel (Englisch)
Development of an UnaG-based biosensor for sensitive bilirubin detection
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
vii, 52 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
David Berry
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
44 Medizin > 44.43 Medizinische Mikrobiologie
AC Nummer
AC17639841
Utheses ID
77382
Studienkennzahl
UA | 066 | 220 | |