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Phenotypic plasticity in cancer-associated fibroblasts and its functional impact on colorectal cancer
Elisa Ebner
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molecular Biology
Betreuer*in
Helmut Dolznig
DOI
10.25365/thesis.79323
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-13518.80359.105488-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Tumormikroumgebung (TMU) spielt eine entscheidende Rolle bei der Progression, Metastasierung und Therapieresistenz bei Krebs. Tumor-assoziierte Fibroblasten (TAFs) stellen den vorherrschenden Zelltyp dar und sind zentrale Vermittler der Remodellierung der extrazellulären Matrix (ECM), der Zytokinsekretion sowie der Modulation immunologischer Reaktionen. Trotz ihrer zentralen Funktion ist die TAF-Biologie komplex, da TAF hochgradig heterogen sind, von unterschiedlichen Zelltypen abstammen und bislang keine standardisierten Marker zur zuverlässigen Identifikation aufweisen. Diese In-vitro-Studie untersucht, wie Zytokine der TMU die Expression phänotypischer Marker von aus kolorektalem Karzinom abgeleiteten TAFs beeinflussen. Hierzu wurden TAFs mit Fibrose-assoziierten Zytokinen (IL-4, IL-13), entzündlichen Zytokinen (IL-1β und TNF-α) sowie TGF-β1, einzeln oder in Kombination, behandelt. Die Expression der am häufigsten verwendeten TAF-Marker im kolorektalen Karzinom – alpha-smooth muscle Aktin (α-SMA) und Fibroblasten aktivierendes Protein (FAP) – wurde mittels Immunfluoreszenz-Färbemethoden quantifiziert durch In-Cell-Western-Assays und konfokaler Mikroskopie. TAF exprimierten unbehandelt ein Grundlevel von α-SMA. IL-4 und IL-13 induzierten eine erhöhte Expression von α-SMA, unabhängig vom TGF-β1-Rezeptor (ALK5), jedoch weniger stark als TGF-β1. IL-1β und TNF-α beeinflussten α-SMA nicht. FAP wurde durch TGF-β1 hochreguliert. IL-4 allein induzierte FAP nicht, jedoch signifikant in Kombination mit TGF-β1. IL-1β und TNF-α beeinflussten FAP moderat. Darüber hinaus veränderten die Zytokine die Expression weiterer TAF-Marker wie PD-L2, IL-1R1 und Podoplanin (PDPN), was die Eigenschaft der phänotypischen Plastizität von TAFs hervorhebt. Organoide von Patienten mit kolorektalem Karzinom wurden in konditionierten Medien (KM) von Zytokin vorbehandelten TAFs kultiviert. Der ATP-Gehalt der Organoide wurde mit Cell Titer-Glo 3D auf Basis eines Luciferase-Assays gemessen. Das KM von mit IL-1β + TNF-α vorbehandelten TAFs erhöhte signifikant den zellulären Gehalt von ATP, jedoch wurden die stärksten protumorigen Effekte nach Behandlung mit der Kombination IL-4 + IL-1β + TNF-α + TGF-β1 beobachtet. Darüber hinaus wurde ein auf einem Transwell-basiertes Co-Kultursystem (organoid-organotypic assay, OOTA) aus Patienten-Organoiden und TAFs desselben Patienten etabliert. Die Zytokinvorbehandlung führte zu deutlichen morphologischen Veränderungen in den Organoiden. Konfokale Bildgebung zeigte zytokin-spezifische Effekte auf Proliferation (Ki-67), Apoptose (gespaltene Caspase-3) sowie auf mesenchymale Marker (α-SMA und FAP). IL-1β + TNF-α förderten sowohl Proliferation als auch Apoptose, während IL-4 + TGF-β1 die Proliferation reduzierten. Im Gegensatz zum vorigen Experiment bewirkte IL-4 + TGF-β1 die stärkste α-SMA-Induktion. Die maximale FAP-Expression wurde, wie zuvor in 2D-Kultur, bei der Kombination aller vier Zytokine beobachtet. Diese Ergebnisse verdeutlichen die dynamische Regulation von TAF-Phänotypen durch Zytokine der TMU und deren funktionellen Einfluss auf das Verhalten von Tumorzellen. Eine verbesserte Charakterisierung von TAF-Subtypen ist essenziell, da ihre Präsenz mit der Prognose der Patienten korreliert und sie zunehmend als therapeutische Zielstrukturen im kolorektalen Karzinom untersucht werden. Weitere Studien sind erforderlich, um ihren prognostischen Wert und ihr Potenzial für klinische Interventionen zu klären.
Abstract
(Englisch)
The tumour microenvironment (TME) plays a critical role in cancer progression, metastasis, and therapeutic resistance. Among its components, cancer-associated fibroblasts (CAF) represent the predominant cell type and are key mediators of extracellular matrix (ECM) remodelling, cytokine secretion, and modulation of immune responses. While CAFs are a crucial part of the TME, understanding their biology is challenging due to their heterogeneity, diverse origins, and the current lack of reliable, standardised markers. This in vitro study investigates the influence of cytokines within the TME on the expression of phenotypic markers of colorectal cancer (CRC). CAF were treated with fibrosis-associated cytokines (IL-4, IL-13), inflammatory cytokines (IL-1β and TNF-α), and TGF-β1, either alone or in combination. The expression of most widely used colorectal CAF markers—alpha-smooth muscle actin (α-SMA) and fibroblast activation protein (FAP)—was quantified using immunofluorescence staining assessed by In-Cell Western and confocal imaging. CRC-CAF expressed basal α-SMA levels. IL-4 and IL-13 treatment independently upregulated α-SMA in a TGF-β1-receptor (ALK5)-independent manner, though less potently than TGF-β1. IL-1β and TNF-α did not downregulate basal α-SMA levels. FAP was significantly upregulated by TGF-β1 treatment. FAP expression was not induced by IL-4 alone but was significantly upregulated when combined with TGF-β1. IL-1β and TNF-α moderately upregulated FAP. All four cytokines (IL-4 + TGF-β1 + IL-1β + TNF-α) upregulated α-SMA and FAP the most significantly. Cytokine treatment also modulated expression of additional CAF markers, including PD-L2, IL-1R1, and podoplanin (PDPN), highlighting the phenotypic plasticity of CAFs. To assess functional consequences, conditioned media (CM) from cytokine-pretreated CAFs was applied to patient-derived colorectal cancer organoids (PDOs). IL-1β + TNF-α-treated CAF-CM significantly increased the viability (measured by Cell Titer-Glo 3D) of PDOs, with the most substantial pro-tumourigenic effects observed following treatment with the combination of all four cytokines. Additionally, a matched PDO-CAF co-culture system was established using a transwell-based organoid-organotypic assay (OOTA). Cytokine treatment induced distinct morphological changes in organoids. Confocal imaging revealed cytokine-specific effects on proliferation (Ki-67), apoptosis (cleaved caspase-3), and mesenchymal markers (α-SMA and FAP). IL-1β + TNF-α promoted both proliferation and apoptosis, whereas IL-4 + TGF-β1 reduced proliferation. Contrary to previous results in 2D, α-SMA was upregulated the most with IL-4 + TGF-β1 in the OOTA. Maximum FAP expression occurred, like in 2D culture, with the combination of all four cytokines. These findings underscore the dynamic regulation of CAF phenotypes by TME cytokines and their functional impact on tumour cell behaviour. Improved characterisation of CAF subsets is essential, given their correlation with patient prognosis and growing interest as therapeutic targets in colorectal cancer. Further studies are warranted to elucidate their prognostic value and potential for clinical intervention.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
kolorektales Karzinom Tumormikroumgebung Zytokine Organoide Tumoroide 3D Zellkultur
Schlagwörter
(Englisch)
colorectal cancer CRC Tumormicroenvironment TME Cytokines organoids tumoroids patient derived organoids co-culture FAP α-SMA IL-4 TGF-β IL-1β TNF-α inflammation PD-L2 podoplanin IL-1R1 3D culture confocal
Autor*innen
Elisa Ebner 
Haupttitel (Englisch)
Phenotypic plasticity in cancer-associated fibroblasts and its functional impact on colorectal cancer
Paralleltitel (Deutsch)
Phänotypische Plastizität von tumorassoziierten Fibroblasten und ihre funktionelle Auswirkung auf das kolorektale Karzinom
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
168 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Helmut Dolznig
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC17643576
Utheses ID
77644
Studienkennzahl
UA | 066 | 865 | |