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Functional and genetic dissection of transcription factor-mediated neuronal conversions from embryonic stem cells
Gintautas Vainorius
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium Molecular Biosciences Molekulare Biologie
Betreuer*in
Ulrich Elling
DOI
10.25365/thesis.79671
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29862.93688.380084-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
In den letzten Jahrzehnten hat die ektopische Expression von lineagespezifischen Transkriptionsfaktoren (TFs) die direkte Umprogrammierung von Zellschicksalen ermöglicht. Dies hat neue Einblicke in die Plastizität zellulärer Identität sowie vielversprechende Perspektiven für die regenerative Medizin eröffnet. Trotz bedeutender Fortschritte bleiben jedoch grundlegende Fragen unbeantwortet. Eine Vielzahl von TFs und deren Kombinationen kann neue Zellschicksale induzieren, doch ist unklar, ob bestimmte TFs inhärent effektiver oder mechanistisch vorteilhafter sind als andere. Die direkten Auswirkungen der TF-Wahl auf Reprogrammierungseffizienz, -treue und -sicherheit sind bislang weitgehend unerforscht. Zudem ist ungewiss, ob diese Übergänge durch direkte Umwandlung erfolgen, Zwischenzustände durchlaufen oder alternative Zelllinien erzeugen – von denen einige unerwünscht oder sogar schädlich sein könnten. Auch die Mechanismen, durch die verschiedene TFs den Übergang zwischen Zellzuständen steuern, sind weitgehend unbekannt, was die rationale Entwicklung von Reprogrammierungsstrategien erschwert. In dieser Studie habe ich mich auf zwei proneurale basic-helix-loop-helix-TFs konzentriert: Ascl1 und Neurogenin2 (Ngn2), die beide in der Lage sind, murine embryonale Stammzellen (mESCs) in induzierte Neuronen (iNs) umzuwandeln. Obwohl sie strukturelle Ähnlichkeiten und vergleichbare entwicklungsbiologische Funktionen aufweisen, aktivieren sie in mESCs nur teilweise überlappende transkriptionelle Programme. Die Expression von Ascl1 führt rasch zur Auflösung des Pluripotenznetzwerks und zur Etablierung eines neuronalen Schicksals, erzeugt jedoch zusätzlich eine trophoblastenähnliche Zellpopulation – vermutlich aufgrund seiner Ähnlichkeit zu Ascl2, einem trophoblastenspezifischen TF. Im Gegensatz dazu initiiert Ngn2 eine stärker vernetzte transkriptionelle Antwort, wobei die Zellen über einen neuralen Stammzell-ähnlichen Zwischenzustand differenzieren, unterstützt durch eine unvollständige Abschaltung des Pluripotenznetzwerks. Ein CRISPR-Cas9-Knockout-Screen zeigte, dass Ascl1 – im Gegensatz zu Ngn2 – stärker auf Faktoren angewiesen ist, die Pluripotenz und Zellzyklus regulieren, wie etwa den Transkriptionsrepressor Tcf7l1. Nach Knockout von Tcf7l1 gelingt es den Zellen nicht, Cdkn1c hochzuregulieren, den Zellzyklus zu verlassen und den iN-Zustand zu etablieren. Die Überexpression von Cdkn1c hingegen führt zum Zellzyklusarrest und stellt die neuronale Umwandlung wieder her. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Zellschicksalsumwandlungen selbst bei eng verwandten Transkriptionsfaktoren über unterschiedliche mechanistische Pfade verlaufen können. Diese Pfade sind durch einzigartige transkriptionelle und funktionelle Eigenschaften sowie durch unterschiedliche Nebenpopulationen gekennzeichnet, was die Bedeutung eines tieferen Verständnisses der zugrunde liegenden Prozesse bei Zellschicksalsübergängen unterstreicht.
Abstract
(Englisch)
Over the past decades, ectopic expression of lineage-specifying transcription factors (TFs) has enabled direct cell fate conversion, offering new insights into cellular identity change and maintenance, and potential for regenerative medicine. Despite significant advances in the field, several fundamental issues remain unresolved. A wide array of TFs and their combinations have been shown to be able to instruct a new cell fate, yet it is unclear whether certain TFs are inherently more effective or mechanistically advantageous than others. The direct implications of TF choice on reprogramming efficiency, fidelity, and safety remain largely unexplored. Furthermore, it is also uncertain if these transitions occur via direct conversion, involve intermediate states or produce alternative lineages, some of which may be undesirable or even detrimental. Finally, the mechanisms by which different TFs orchestrate the transitions between cell states remain elusive, limiting the rational design of reprogramming strategies. In this study, I focused on two proneural basic helix loop helix TFs, Ascl1 and Neurogenin2 (Ngn2), both capable of converting mouse embryonic stem cells (mESC) into induced neurons (iN). Besides sharing structural and developmental role similarities, they activate only partially overlapping transcriptional response in mESC. Expression of Ascl1 rapidly dismantles the pluripotency network and installs a new cellular fate, but also induces a trophoblast-like cell population, likely due to its similarity to Ascl2, a trophoblast specific TF. In contrast, Ngn2 initiates a more interconnected transcriptional response, with cells transitioning through a neural stem cell-like intermediate, supported by an incomplete shutdown of the pluripotency network. CRISPR-Cas9 knockout screen revealed that Ascl1, but not Ngn2, relies more on factors regulating pluripotency and cell cycle, such as a transcriptional repressor Tcf7l1. Upon Tcf7l1 knockout, cells fail to upregulate Cdkn1c, exit cell cycle, and establish iN state. However, overexpression of Cdkn1c induces cell cycle arrest and restores iN conversion. These results demonstrate that cell type conversion can proceed through distinct mechanistic paths, despite being driven by closely related transcription factors. Each path is characterized by unique transcriptional and functional properties and distinct side populations, underscoring the importance of understanding the processes underlying cell fate transitions.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Stammzellen CRISPR Neuronale Reprogrammierung
Schlagwörter
(Englisch)
Stem cells CRISPR Neuronal reprogramming
Autor*innen
Gintautas Vainorius
Haupttitel (Englisch)
Functional and genetic dissection of transcription factor-mediated neuronal conversions from embryonic stem cells
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
100 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Anna Kicheva ,
Noelia Urban Avellaneda
AC Nummer
AC17717493
Utheses ID
77981
Studienkennzahl
UA | 794 | 620 | 490 |