Detailansicht
Characterization of novel porins from Protochlamydia amoebophila UWE25
Alexandra Hörmann
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Matthias Horn
DOI
10.25365/thesis.8663
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29453.54389.816061-5
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Phylum Chlamydiae beinhaltet einige wichtige bakterielle Krankheitserreger, die sich durch eine obligat intrazelluläre Lebensweise und einen charakteristischen Lebenszyklus auszeichnen. Eine kritische Phase stellt dabei das Eintreten des Bakteriums in die eukaryotische Wirtszelle dar, bei der Außenmembranproteinen eine wichtige Rolle spielen.
In P. amoebophila wurde eine Porin-Familie entdeckt, deren Mitglieder - pc0870, pc1077, pc1489 und pc1860 - möglicherweise die Funktion des „major outer membrane protein“ (MOMP) der klinischen Chlamydien ersetzen könnten. E. coli wurde als geeignetes Modelsystem herangezogen, um die vier potentiellen Porine heterolog zu exprimieren. Als Ergebnis konnte die Überexpression von allen vier Porin-Kandidaten mittels SDS-PAGE und Western Blot Analyse detektiert werden. Messungen der optischen Dichte während heterologer Expression konnten jedoch nicht zeigen, dass die Porine Kanäle in der Außenmembran bilden und somit letale Auswirkungen auf die Wirtszelle haben. Weiters wurde die Produktion von Antikörpern als geeignete Methode gewählt, um die Lokalisierung des Porins pc1077 in der Außenmembran von P. amoebophila zu zeigen.
Das Transkriptionsprofil von pc1489 wurde mittels qPCR untersucht. Basierend auf Studien der Außenmembrankomponenten von klinischen Chlamydien wurde pc1489 dem „late gene“ Cluster zugeordnet, dessen Mitglieder vor allem zu späteren Zeitpunkten des Entwicklungszyklus große Wichtigkeit zugesprochen wird.
Außerdem wurde ein neuer Standardantikörper generiert, um mit Immunfluoreszenz Zellpermeabilität zu demonstrieren. Das cytoplasmatische Protein Dnak wurde erfolgreich in E. coli überexprimiert und spezifische Antikörper wurden generiert. Die Spezifität dieser Antikörper konnte mittels Immunfluoreszenz visualisiert und durch Western Blot Analysen bestätigt werden. Außerdem detektiert der Standardantikörper gegen DnaK von P. amoebophila erfolgreich homologe Proteine in Waddlia chondrophila und Simkania negevensis.
Abstract
(Englisch)
The phylum Chlamydiae comprises important pathogens, which share an obligate intracellular lifestyle and a characteristic biphasic developmental cycle. Attachment and entering a host cell represent crucial steps, whereby outer membrane proteins are considered to be key players.
Four putative porins from P. amoebophila - pc0870, pc1077, pc1489 and pc1860 - are proposed for being responsible for the substitution of the major outer membrane protein (MOMP) of the Chlamydiaceae. All four porins were successfully overexpressed in E. coli as shown by SDS-PAGE and Western blot analysis. Measurements of the optical density during heterologous expression did not detect toxic effects of the porins, which are supposed to form channels in the outer membrane of E. coli if processed correctly. Antibodies against the putative porin pc1077 were generated to visualize its localization in the outer membrane by immunofluorescence analysis.
qPCR promised insights into the transcriptional profil of the porin pc1489. Based on findings of outer membrane proteins of clinical chlamydiae, pc1489 is regarded as a member of the late gene cluster, being important during late stages of the developmental cycle.
A third project focused on the generation of a standard antibody to show cell permeability in immunofluorescence analyses. The cytoplasmic protein DnaK was successfully overexpressed in E. coli, followed by generation of specific antibodies. The specificity was successfully tested in immunofluorescence experiments by showing intracellular localization and was also proven by Western blot. Antibodies against DnaK of P. amoebophila also detect homologues of this protein in Waddlia chondrophila and Simkania negevensis.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
chlamydia P. amoebophila outer membrane porins heterologous expression antibody generation DnaK
Schlagwörter
(Deutsch)
Chlamydien P. amoebophila Außenmembran Porine heterologe Expression Antikörperproduktion DnaK
Autor*innen
Alexandra Hörmann
Haupttitel (Englisch)
Characterization of novel porins from Protochlamydia amoebophila UWE25
Paralleltitel (Deutsch)
Charakterisierung von neuen Porinen von Protochlamydia amoebophila UWE25
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
142 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Matthias Horn
Klassifikation
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
AC Nummer
AC08033310
Utheses ID
7813
Studienkennzahl
UA | 441 | | |