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Investigation and influence of a phospholipase A2 from the venom of the Mexican West-Coast rattlesnake (Crotalus basilicus) on human blood coagulation using a thrombin generation assay
Anna Grösslinger
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Pharmazie
Betreuer*in
Peter Turecek
DOI
10.25365/thesis.80226
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-13858.32426.345376-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Diese Masterarbeit untersucht den Effekt von Proteinen aus dem Gift der Crotalus basiliscus auf die menschliche Blutgerinnung: eine basische Phospholipase A2 (PLA2) und Proteasen, die alpha-2 Makroglobulin (a2M) inhibieren. Im Allgemeinen sind PLA2s für ihre gerinnungshemmende Aktivität bekannt. Der zugrundeliegende Mechanismus basiert einerseits auf der Hydrolyse von Phospholipiden und andererseits auf der Bindung von Blutgerinnungsfaktoren. (Saikia & Mukherjee, 2017) Im Rahmen dieser Arbeit sollen der Mechanismus der PLA2 und ihre Rolle in der Funktion des Giftes untersucht werden. a2M ist ein Plasmaprotein, das ein breites Spektrum an Proteasen inhibiert, einschließlich Thrombin. Trotz der Inhibition bleibt Thrombin jedoch in der Lage, kleine Peptidsubstrate zu spalten. Dies stellt ein Problem für den Thrombin-Generierungs-Assay (TGA) dar, da sich die Kurve des freien Thrombins von der Kurve der amidolytischen Aktivität unterscheidet, was wiederum die quantitative Bestimmung der Fläche unter der Kurve, ein wichtiger Parameter im TGA, erschwert. Die Serumkonzentration von a2M wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst, darunter Alter, Geschlecht und verschiedene Erkrankungen, was eine mathematische Korrektur der Kurven zusätzlich erschwert. Der Einsatz von a2M-hemmenden Proteasen wurde als potenzielle Lösung vorgeschlagen, um die amidolytische Restaktivität des a2M-Thrombin-Komplexes zu reduzieren oder gänzlich zu unterdrücken. (Rijkers et al., 1998; Svoboda et al., 1995) Die Proteine wurden mittels Größenausschluss- und Anionenaustauschchromatographie aufgetrennt und deren Effekt auf die Blutgerinnung mittels TGA untersucht. Zudem wurde die PLA2-Aktivität mithilfe eines Assays quantifiziert, der auf der hydrolytischen Spaltung von Phospholipiden basiert. Die a2M-Aktivität wurde durch einen Plasmin-Inhibitor-Assay bestimmt. Vier Substanzen (Varespladib, Nifedipin, Quinacrine und Nisoldipin) wurden ausgewählt, um die PLA2-Aktivität zu inhibieren. Die a2M-inhibierenden Proteasen zeigten eine Aktivität im Plasmin-Inhibitor-Assay, führten jedoch nach Zugabe zu Plasma für den TGA zu einer Hemmung der Thrombinbildung. Trotz einer Aufreinigung in zwei Schritten konnten in den Fraktionen Verunreinigungen mit einem Molekulargewicht von etwa 10 kDa nachgewiesen werden. Dies deutet auf PLA2 hin. Die PLA2 hemmte die Thrombin-Generierung in zeit- und phospholipidabhängiger Weise. Der gerinnungshemmende Effekt vergrößerte sich bei verlängerter Inkubationszeit und verringerte sich bei Erhöhung der Phospholipidkonzentration. Varespladib hemmte den gerinnungshemmenden Effekt der PLA2 im TGA und Nisoldipin hatte einen geringen Effekt darauf. Nifedipin und Quinacrine hemmten die PLA2-Aktivität im PLA2-Assay, jedoch nicht im TGA. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass das Gift des Crotalus basiliscus eine basische und gerinnungshemmende PLA2 und a2M-inhibierende Proteasen enthält. Varespladib hemmt die PLA2-Aktivität signifikant. Diese Effekte lassen sich mithilfe des TGA nachweisen. Der potenzielle Nutzen der a2M-inhibierenden Proteasen konnte aufgrund gerinnungshemmender Effekte, die vermutlich durch Verunreinigungen verursacht wurden, nicht beurteilt werden.
Abstract
(Englisch)
This thesis examines the effect of proteins from the Crotalus basiliscus venom on human blood coagulation: a basic phospholipase A2 (PLA2) and proteases that inhibit the alpha-2 macroglobulin (a2M). In general, PLA2s are known for their anticoagulant activity. The underlying mechanism is either hydrolysis of phospholipids or binding to blood coagulation factors. (Saikia & Mukherjee, 2017) This study aims to explore the mechanism of PLA2 in the function of the venom. a2M is a plasma protein, which inhibits a wide range of proteases, including thrombin. When inhibiting thrombin, thrombin can still cleave small peptide substrates. This is a problem of the thrombin generation assay (TGA), because the free thrombin curve is not identical to the amidolytic activity curve, which impacts the area under the curve, which is an important quantitative readout of TGA. Several factors influence the a2M serum concentration, including age, sex, and several pathologies, making a mathematical correction of the curve based on the mean a2M concentration difficult. Use of a2M-inhibiting proteases was suggested as a potential solution to reduce or completely diminish the residual amidolytic activity of the a2M-thrombin complex. (Rijkers et al., 1998; Svoboda et al., 1995) The proteins were purified using size-exclusion and anion-exchange chromatography, and their effect on blood coagulation was investigated with the TGA. Furthermore, the PLA2 activity was measured using an assay based on the hydrolytic activity of PLA2s towards phospholipids, and the a2M inhibiting activity was evaluated with a plasmin inhibitor assay. Additionally, four substances (Varespladib, Nifedipine, Nisoldipine, and Quinacrine) were chosen to inhibit the PLA2 activity. The a2M inhibiting proteases showed activity in the plasmin inhibitor assay, but inhibited thrombin generation when added to the plasma for the TGA. After the purification steps, the fractions were not entirely pure, and impurities with a molecular weight of approximately 10 kDa were found, suggesting the presence of PLA2s. The PLA2 inhibited thrombin generation in a time- and phospholipid-dependent manner. The anticoagulant effect was enhanced by increasing the incubation time of the PLA2. Raising the phospholipid concentration in the TGA reagent decreased the inhibitory effect on thrombin generation. Varespladib inhibited the anticoagulant impact of PLA2 in the TGA, and Nisoldipine only had a minor effect. Nifedipine and Quinacrine inhibited the PLA2 activity in the activity assay but not in the TGA. From these findings, it can be concluded that Crotalus Basiliscus venom contains basic and anticoagulant PLA2 and a2M-inhibiting proteases. Varespladib can significantly inhibit PLA2 activity. These effects can all be measured using the TGA. The potential use of the a2M-inhibiting proteases could not be assessed due to an anticoagulant effect possibly caused by the impurities.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Crotalus basiliscus Phospholipase A2 Blutgerinnung Thrombin-Generierungs-Assay
Schlagwörter
(Englisch)
Crotalus basiliscus Phospholipase A2 Blood Coagulation Thrombin Generation Assay
Autor*innen
Anna Grösslinger
Haupttitel (Englisch)
Investigation and influence of a phospholipase A2 from the venom of the Mexican West-Coast rattlesnake (Crotalus basilicus) on human blood coagulation using a thrombin generation assay
Paralleltitel (Deutsch)
Untersuchungen des Einflusses einer Phospholipase A2 aus dem Gift der Basilisken-Klapperschlange (Crotalus basiliscus) auf die Blutgerinnung des Menschen mittels Thrombin-Generierungs-Assay
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
109 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Peter Turecek
AC Nummer
AC17771713
Utheses ID
78764
Studienkennzahl
UA | 066 | 605 | |