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Construction of biosensors detecting secondary metabolites in Streptomyces
Moritz Angerer
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Pharmazie
Betreuer*in
Sergey Zotchev
DOI
10.25365/thesis.80229
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-19239.45642.682228-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Actinomyceten und insbesondere Streptomyces, produzieren eine Vielzahl von Naturstoffen, welche vor allem im Bereich der Medizin und Landwirtschaft genutzt werden. Globale Probleme wie der Anstieg der Krebsinzidenz, die zunehmende bakterielle Resistenz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen und die steigende Resistenz von Organismen gegenüber Pestiziden machen die Entdeckung neuer Wirkstoffe erforderlich. Die Gene, welche für die Produktion eines Sekundärmetaboliten verantwortlich sind, liegen im Genom von Streptomyces als Cluster vor. Diese Sequenzen werden als Biosynthese Gencluster (BGC) bezeichnet. Mit Hilfe von genome mining können BGCs identifiziert werden. Viele dieser BGCs produzieren ihren zugehörigen Metaboliten nur unter bestimmten Bedingungen in ihrer natürlichen Umgebung und bleiben unter Laborbedingungen stumm. Es gibt verschiedene Ansätze, um einen stillen BGC zu aktivieren; eine davon ist die Überexpression regulatorischer Gene. Biosensoren können helfen, den analytischen Aufwand nach Aktivierungsexperimenten zu reduzieren. Für dieses Projekt wurden fünf TetR-ähnliche Repressoren aus Region 2.34 von Streptomyces RLA012, isoliert aus der Rhizosphäre von Leontopodium nivale subsp. alpinum, ausgewählt, um rekombinante Biosensorstämme zu erzeugen, um die Aktivität dieses BGC zu untersuchen. Diese basieren auf dem Reportergen bpsA, welches zur Produktion des blauen Pigments Indigoidin führt. Ein Biosensorstamm zeigte die Produktion von Indigoidin. Um zu untersuchen, ob dies auf die Aktivität des BGC zurückzuführen ist, wurde ein Knockout-Vektor konstruiert. Außerdem wurden Überexpressionsvektoren basierend auf fünf regulatorischen Sequenzen erstellt. Die Einführung des Knockout-Vektors und der meisten Überexpressionsvektoren, mit Hilfe von Conjugation, schlug fehl. Die erzeugten rekombinanten Stämme einer Fermentation unterzogen. Die daraus hergestellten Extrakte wurden mittels Hochleistungsflüssigchromatographie analysiert. Eine Farbveränderung konnte in einem Stamm beobachtet werden. Ein Extrakt zeigte eine leichte Bioaktivität gegenüber zwei Testorganismen in einem Scheibendiffusionstest. Um zu identifizieren, welche Verbindung für die Bioaktivität verantwortlich ist, ob sie mit Region 2.34 oder einem anderen zuvor stillen BGC assoziiert werden kann und ob es sich möglicherweise um eine unbekannte Verbindung handelt, wären weitere Untersuchungen erforderlich.
Abstract
(Englisch)
Actinomycetes and in particular Streptomyces are prolific bacterial producers of secondary metabolites with widespread usages in medicine and agriculture. Global problems such as the rise of cancer incidence, growing bacterial antimicrobial resistance and increasing resistance of organisms to pesticides call for the discovery of new active ingredients. In Streptomyces the genes responsible for the production of a secondary metabolite are clustered together on the genome. These assemblies of neighbouring genes are called biosynthetic gene clusters (BGCs), which can be identified using advanced bioinformatics. Many of these BGCs only generate their corresponding metabolites under certain circumstances in their natural environments and remain silent under laboratory conditions. There are different approaches to activate a silent BGC, one such method being the overexpression of regulatory genes. Biosensors, which can sense the production of BGC-specific metabolite can help to reduce the analytical workload after activation experiments. For this project 5 TetR like repressors, from region 2.34 of Streptomyces sp. RLA012 isolated from the rhizosphere of Leontopodium nivale subsp. alpinum, were selected to create recombinant biosensor strains based on the reporter gene bpsA responsible for production of the blue pigment indigoidine, to examine the activity of a selected BGC. 1 Biosensor strain showed production of indigoidine, and to investigate whether this was due to the activity of the BGC a knockout vector was constructed. Furthermore, overexpression vectors, based on 5 regulatory sequences, were constructed. The introduction of the knockout vector and most overexpression vectors into the biosensor strain, however, failed for unknown reasons. The recombinant strains created through this process were fermented nonetheless and extracts were analysed with high performance liquid chromatography. A change in colour could be observed in 1 strain and one extract showed some bioactivity against 2 test organisms in a disc diffusion assay. To identify which compound is responsible for the bioactivity, and whether it can be linked to a particular BGC in Streptomyces sp. RLA012, further investigations are needed.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Streptomyces Genom mining BGC Naturstoffe Sekundärmetaboliten
Schlagwörter
(Englisch)
Streptomyces genome mining BGC natural products secondary metabolites
Autor*innen
Moritz Angerer
Haupttitel (Englisch)
Construction of biosensors detecting secondary metabolites in Streptomyces
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
87 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Sergey Zotchev
Klassifikationen
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie ,
58 Chemische Technik > 58.30 Biotechnologie
AC Nummer
AC17771794
Utheses ID
79170
Studienkennzahl
UA | 066 | 605 | |