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Deletion of a ribosomal dimerization factor of the 30S ribosomal subunit in the hyperthermophile Pyrococcus furiosus
Michaela Mach
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molecular Microbiology, Microbial Ecology and Immunobiology
Betreuer*in
Christa Schleper
DOI
10.25365/thesis.80490
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-12344.71124.817598-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Ribosomale Dimerisierungsfaktoren spielen eine zentrale Rolle in der Regulation der Translation in Organismen. Während die Dimierisierungsvorgänge der Ribosomen in Bakterien und Eukaryoten gut erforscht sind, ist deren Funktion in Archaeen noch nicht genau bekannt. Ziel dieser Studie war es, einen Deletionsstamm von Pyrococcus furiosus zu erzeugen, bei dem der ribosomale Dimerisierungsfaktor PF0560 der Archaeen fehlt, um seine Funktion in diesem Organismus zu untersuchen. Dieses Protein ist für Bildung eines 30S-30S-Dimers unter Nahrungsmangelbedingungen verantwortlich und spielt hierbei eine wichtige Rolle bei der Regulation der Ribosomen im Zuge der Translation in Archaeen. Zudem könnte PF0560 in Pyrococcus furiosus, einem Organismus, der unter extrem hohen Temperaturen gedeiht, eine zentrale Rolle bei der Regulierung der energieintensiven Translation übernehmen. Dies könnte den Organismen eine Strategie zur Überlebenssicherung unter extremen Bedingungen bieten. Da die genau Rolle noch nicht bekannt ist, wie dieser Faktor Ribosomen in ihrer Funktion beeinflusst, ist die Forschung der ribosomalen Faktoren in Archaea essentiell. Um daher mehr Einblicke in die funktionelle Rolle des ribosomalen Dimerisierungsfaktors (aRDF) der Archaeen zu gewinnen, wurde das Protein im Zuge dieser Arbeit im Organismus deletiert und das Wachstum diese resultiereten Mutante analysiert. Hierbei wurde eine Deletionsstrategie verwendet, die ein genetisches Manipulationssystem ermöglichte. Grundlage dieser Strategie war die homologe Rekombination, bei der das Gen pf0506 mittels eines Doppel-Crossover ausgetauscht wurde. Hierzu wurden die Regionen, die den aRDF ,codiert durch pf0560, flankieren, amplifiziert und mit einem für Pyrococcus furiosus essentiellen Gen verbunden. Das zusammengesetzte Konstrukt wurde in eine auxotrrophe Mutante eingeführt, dem dieses essentielle Gen fehlt und für das Wachstum der hyperthermophilen Archaeen entscheidend ist. Auf diese Weise wurden homologe Regionen flankierend um den aRDF bereitgestellt, die mit dem essentiellen Gen an der Stelle des aRDF verknüpft waren. Nach der Transformation konnte ein Doppel-Crossover an den homologen Regionen stattfinden, der zum Austausch von pf0560 durch das essentielle Gen führte. Mit dieser Strategie konnten positive Transformanten direkt anhand ihres Wachstums identifiziert werden. In der weiteren Arbeit wurde die Deletionsmutante im Wachstum überwacht und es konnte beobachtet werden, dass der ribosomale Dimierisierungsfaktor eine wichtige Rolle bei der Stabilität der Zellen spielt, insbesondere in der stationäre Phase. Darüber hinaus wurde dieses Deletionssystem in dieser Arbeit verwendet, um ein kleineres ribosomales Protein in Pyrococcus furiosus zu deletieren. Hierbei sollte das ribosomale Protein L41e, das als ribosomales Protein in mehreren Lebensbereichen verbreitet ist, in Pyrococcus furiosus entfernt werden. Das Protein L41e ist dafür bekannt, mit der 50S-Untereinheit der Ribosomen zu interagieren und spielt eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung der Kontakte zwischen verschiedenen ribosomalen Proteinen und rRNA-Regionen. Insbesondere beeinflusst das Protein die Effizienz der Proteinsynthese. Da die Funktion von L41e in anderen Lebensdomänen besser bekannt ist, bleibt allerdings die essentielle Rolle von L41e in Archaeen bislang unklar. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit das Protein L41e in Pyrococcus furiosus deletiert, um seinen Einfluss in Archaeen zu untersuchen. Auch hierbei wurde das genetische Deletionssystem verwendet, basierend auf der Erzeugung von homologen Regionen stromauf- und stromabwärts von L41e in der auxotrophen Mutante. Durch Verbinden der upstream- und downstream-Regionen von L41e mit dem essentiellen Gen sollte L41e mittels homologer Rekombination deletiert werden. Allerdings konnte L41e mit diesem Ansatz nicht entfernt werden. Dies deutet darauf hin, dass L41e in Archaeen möglicherweise eine wesentlichere Rolle spielt als bisher angenommen. Auf Basis dieser Studie wird daher deutlich, wie notwendig die Forschung an Archaeen und deren ribosomalen Proteinen ist, um die Mechanismen zu verstehen, die diesen Organismen das Leben unter extrem unterschiedlichen Bedingungen ermöglichen.
Abstract
(Englisch)
Ribosomal dimerization factors play important roles in the regulation of protein synthesis in organisms. Since the processes underlying ribosome dimerization are well studied in bacteria and eukaryotes, its functions in archaea remain poorly understood. In this study, the goal was to create a deletion strain in Pyrococcus furiosus, in which the archaeal ribosomal dimerization factor PF0560 was missing, in order to investigate its function in this organism. As PF0560 mediates the formation of a 30S-30S dimer during starving conditions, the factor might play an important role in regulating the translation in archaea. Moreover, as Pyrococcus furiosus exists as an organism thriving under extremely high temperatures, PF0560 might serve as a key player in down regulating the energy consuming translation event. This might provide a strategy for the organisms to survive under those extreme conditions. But, how PF0560 influences the cell in its functions remains still elusive. In order to gain more insight into the functional role of the archaeal ribosomal dimerization factor, namely aRDF, during this work the protein was deleted in the organism and further, the growth of the mutant strain was monitored. Hereby, a deletion strategy was utilized, that enabled a genetic manipulation system. In this strategy, homologous recombination was used as the basis for deleting the gene via a double cross over. To do so, regions flanking the aRDF, encoded by pf0560, were amplified and connected to an essential gene in Pyrococcus furiosus. The assembled construct was introduced into an auxotroph mutant strain, missing this essential gene, which is crucial for the growth in hyperthermophile archaea. In this way, homologous regions flanking aRDF, connected to the essential gene at the position of the aRDF, were provided in the organism. Thereby, after the transformation into the auxotroph mutant a double cross over on the homologous regions could take place, that led to exchange of pf0560 with the essential gene. Providing this strategy, positive transformants could directly be screened based on their growth. In the further work, the deletion mutant missing pf0560 was monitored in its growth. Moreover, it could be observed during this work, that pf0560 might play an important role in the stability of cells, especially in cells entering the stationary phase. In addition, during this work the deletion system was used to delete a smaller ribosomal protein in Pyrococcus furiosus. Moreover, the ribosomal protein L41e, that is common as a ribosomal protein spread among several domains of life, should be deleted in Pyrococcus furiosus. Further, the ribosomal protein L41e is known to interact with the 50S subunit of ribosomes and seems to play an important role in the stabilization of the contact among various ribosomal proteins and rRNA regions. Especially, the ribosomal protein influences the efficiency of the protein synthesis. But, due to the fact that the function of L41e is better understood in the other domains of life, the essential role of L41e in archaea remains still unknown. Thereby, during this work the ribosomal protein L41e was deleted in Pyrococcus furiosus in order to investigate, the influence of L41e in archaea. To do so, likewise, in this experiment, the genetic deletion system was utilized. In this way, homologous regions flanking L41e upstream and downstream, were provided in the auxotroph mutant version of Pyrococcus furiosus after transformation. Via assembling the upstream and downstream regions of L41e to the essential gene, L41e should be deleted via homologous recombination in Pyrococcus furiosus. Based on this work, L41e could not be deleted via using this approach. Moreover, this elucidated the finding that L41e might play a more crucial role in archaea than further expected. Still, more research has to be done in order to get more insight into the fundamental role of L41e in the third domain of life. Reliant on this study, this sheds light on the necessity of research in archaea in important ribosomal protein factors, in order to understand its processes enabling archaea to make their living under different living conditions.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Dimerisierungsfaktor in Archaeen Erstellung von Deletionsmutanten
Schlagwörter
(Englisch)
Ribosomal dimerization factors in archaea Creation of mutant strains
Autor*innen
Michaela Mach
Haupttitel (Englisch)
Deletion of a ribosomal dimerization factor of the 30S ribosomal subunit in the hyperthermophile Pyrococcus furiosus
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
104 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Christa Schleper
Klassifikationen
42 Biologie > 42.03 Methoden und Techniken der Biologie ,
42 Biologie > 42.21 Evolution
AC Nummer
AC17791571
Utheses ID
79263
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |