Detailansicht
Genome editing of mutations in patient-derived lung cancer organoids using CRISPR-Cas9-based technologies
Sandy Sulaiman
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molecular Microbiology, Microbial Ecology and Immunobiology
Betreuer*in
Joao Matos
DOI
10.25365/thesis.80992
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-19232.99006.489551-5
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Lungen Adenokarzinom entsteht durch verschiedene genetische Veränderungen, darunter Mutationen in Tumorsuppressor und onkogene Genfusionen, die gemeinsam das Tumorprogressionsverhalten bestimmen. Aufgrund von Resistenzentwicklungen sind diese Mutationen therapeutisch schwierig zu behandeln. Allerdings bieten Patientenabgeleitete Organoide ein physiologisch relevantes Modellsystem, um diese Veränderungen zu untersuchen und neue genomeditierende Methoden zu evaluieren. In dieser Arbeit wurden CRISPR-basierte Technologien in Lungenkrebs-Organoiden eingesetzt, um zwei klinisch relevante genetische Veränderungen funktionell zu analysieren: die TP53 Mutation C275Y sowie die onkogene KIF5B-RET Fusion. Zur Korrektur der TP53 C275Y Mutation (G→A) in der DNA-Bindungsdomäne von p53 wurde das AdeninBasen-Editierung System ABE8e verwendet. Mittels Lentiviren konnten CRISPR Komponenten in die Organoiden geliefert werden und eine hohe A→G-Umwandlungseffizienz von 60–90% erzielt werden. Die Korrektur der Mutation führte zu einer deutlichen Wachstumshemmung der Organoiden (> 75% Verlust lebender Zellen), was auf die Reaktivierung p53-vermittelter tumorsuppressiver Programme hinweist. Im zweiten Teil des Projekts wurde die onkogene KIF5B-RET-Fusion mittels CRISPR-Cas9 gezielt inaktiviert. Das erfolgte über eine virusfreie (m)RNA-Transfektion. Es wurden zwei Strategien entwickelt: (i) eine Breakpoint-spezifische gezielte Inaktivierung und (ii) eine Doppelte Intron-Inaktivierung zur Induktion einer großen Deletion unabhängig von der genauen Fusionsstelle. Eine der verwendeten gRNAs erreichte einen Editingprozentsatz von 15%. Die geringe Effizienz und der ausbleibende phänotypische Effekt könnten auf ein mögliche Gen-Stilllegung der Cas9 oder auf durch mutiertes p53 induzierte fehlerfreie DNA-Reparaturmechanismen zurückzuführen sein, welche die Funktion des KIF5B-RET-Onkogens erhalten und damit die Knockout-Effizienz begrenzen. Insgesamt etabliert diese Arbeit einen robusten Arbeitsablauf für Adenin-Basen-Editierung in patientenspezifischen Organoiden, demonstriert die Machbarkeit der funktionellen Untersuchung von TP53 Punktmutationen im tumorrelevanten Umfeld. Außerdem zeigt diese Arbeit wie genomeditierende Plattformen zur funktionellen Charakterisierung von Krebs verbundene Mutationen beitragen. Damit liefert sie wichtige Grundlagen für die Entwicklung personalisierter Therapiestrategien beim Lungenkrebs.
Abstract
(Englisch)
Lung adenocarcinoma is caused by various genetic alterations, including tumor-suppressor mutations and oncogenic gene fusions, which together shape tumor progression and remain difficult to therapeutically target due to resistance development. Patient-derived lung cancer organoids offer a physiologically relevant model for studying these alterations and evaluating emerging genome-editing strategies. This thesis applies CRISPRbased technologies in lung cancer organoids to functionally dissect two clinically relevant mutations: the TP53 C275Y mutation and the KIF5B–RET fusion oncogene. An adenine base editor (ABE) was used to correct the TP53 C275Y (G→A) mutation within the DNA-binding domain of p53. High-efficiency A→G conversion (60–90%) was achieved in organoids using a lentiviral delivery system. Correction of the mutation resulted in a significant reduction in organoid viability (>75% depletion of live cells) already within three days, indicating reactivation of p53-medited tumor-suppressive programs. The second project aimed to disrupt the oncogenic KIF5B–RET fusion using CRISPR–Cas9 delivered via a virus-free (m)RNA transfection approach. Two strategies were designed: (i) break-point targeting and (ii) dual-intron targeting to induce large deletions independent of the fusion junction. One guide RNA achieved 15% editing. However, low editing and limited phenotypic impact likely resulted from p53-mediated errorfree repair mechanisms. These can potentially preserve the KIF5B–RET oncogene and limit knockout efficiency. These findings establish a robust workflow for base editing in patient-derived organoids and demonstrate the feasibility of studying TP53 hotspot mutations in their native environment and in a patient-specific context. In addition, it demonstrates how genome-editing platforms can facilitate functional characterization of cancer mutations and support the development of personalized therapeutic strategies in non-small cell lung cancer and beyond.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Lungen Adenokarzinom Tumorsuppressor Onkogene Genfusionen Genomeditierende Methoden Organoiden TP53 Adenin Basen-Editierung System ABE CRISPR KIF5B RET Onkogen Lungenkrebs
Schlagwörter
(Englisch)
ABE CRISPR TP53 RET KIF5B Lung Cancer Tumor Suppressor Organoids Gen fusions Fusion oncogenes
Autor*innen
Sandy Sulaiman
Haupttitel (Englisch)
Genome editing of mutations in patient-derived lung cancer organoids using CRISPR-Cas9-based technologies
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
8, 81 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Joao Matos
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
44 Medizin > 44.81 Onkologie
AC Nummer
AC17849450
Utheses ID
79363
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |