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Synthesis of stable isotope-labeled histidine and isoleucine precursors for protein and peptide NMR investigation
Alisa Wimmer
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Chemie
Betreuer*in
Roman Lichtenecker
DOI
10.25365/thesis.80625
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-25394.62524.883827-9
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die NMR-Spektroskopie ist heutzutage eine der wichtigsten Methoden um Struktur, Dynamik und Interaktionen von Proteinen auf atomarer Ebene zu untersuchen. Die Analyse großer Biomoleküle mittels NMR wird jedoch durch Einschränkungen in Auflösung und Sensitivität erschwert. Diese Probleme lassen sich durch die gezielte Einführung von 13C-, 15N- und 2H Isotopen an ausgewählten Positionen überwinden. Dies kann entweder durch uniforme oder selektive Isotopenmarkierung erreicht werden. Ziel dieses Projekts ist die Entwicklung und Optimierung effizienter mehrstufiger Syntheserouten für isotopenmarkierte metabolische Vorläufer der Aminosäuren Histidin und Isoleucin, die den gezielten Einbau von 13C, 15N und 2H in die entsprechenden Aminosäuren eines Proteins ermöglichen. α-Ketobutyrat bzw. 2-Aceto-2-hydroxybutanoat sind metabolische Vorstufen von Isoleucin und wurden bereits erfolgreich für die selektive Isotopenmarkierung von Isoleucin in E. coli Überexpressionssystemen eingesetzt. Das gezielte Isoleucin-Labeling von Proteinen in Säugtierzellen erfordert jedoch eine andere Strategie, da diesen Zellen ein biosynthetischer Weg zur Herstellung von Isoleucin fehlt. 3-Methyl-2-oxopentanoat ist das erste Intermediat des Isoleucin-Abbaus und Produkt einer reversiblen Transaminierung. Diese Verbindung kann in vivo zu Isoleucin umgewandelt werden und stellt somit einen potentiellen Vorläufer für die selektive Markierung in Säugetierzell-basierten Überexpressionssystemen dar. Ein Ziel dieses Projektes ist die Entwicklung einer geeigneten Syntheseroute für die Herstellung eines Isotopologs von 3-Methyl-2-oxopentanoat, welches eine protonierte δ13CH3-Gruppe in einer ansonsten deuterierten Seitenkette enthält. Zudem soll untersucht werden, ob dieser Precursor in vivo durch eine Transaminase-katalysierte Reaktion in Isoleucin umgewandelt und in weiterer Folge effizient in Proteine eingebaut werden kann. Für die selektive Histidin-Markierung wird ein ähnlicher Ansatz verfolgt. 2-Hydroxy-3-(1H-imidazol-4-yl)acrylsäure wurde bereits als Precursor für die selektive und effiziente Isotopenmarkierung von Histidin in E. coli Überexpressionssystemen eingesetzt. Diese Verbindung ist ein Enol-Tautomer des Histidinabbauprodukts Imidazol-4-pyruvat und wird selektiv über die reversible, transaminasekatalysierte Reaktion in den gewünschten Aminosäurerest umgewandelt. In diesem Fall besteht das Ziel darin, verschiedene Isotopologe des beschriebenen Vorläufers mit unterschiedlichen Spinsystemen, nämlich 1H-13C, 1H-15N oder 13C-15N, zu synthetisieren. Je nach Markierungsmuster eignen sich diese Verbindungen für unterschiedliche NMR Anwendungen, um Informationen über Proteinstruktur, -dynamik und -interaktionen zu gewinnen.
Abstract
(Englisch)
NMR spectroscopy is one of the most valuable methods to investigate conformational properties and dynamic processes of proteins at an atomic resolution. However, using NMR to study large biomolecules is hampered by limitations in resolution and sensitivity. These issues can be overcome by strategically introducing 13C, 15N and 2H at specific atomic positions resulting in enhanced signal resolution and simplified spectra. This can be achieved by either uniform protein labelling, segmental isotope labeling or by selective side-chain labelling. The aim of this project is the development of economic and efficient multistep synthetic routes for new isotopologues of selective histidine and isoleucine precursors for protein and peptide NMR investigation. The target molecules are produced from commercially available sources of heavy isotopes using organic synthesis and then applied in E. coli or/and mammalian cell-based overexpression systems to access the corresponding isotope labeled protein samples. α-Ketobutyrate or 2-aceto-2-hydroxybutanoate are early metabolic precursors of isoleucine and have been described as suitable candidates for selective isoleucine labeling in bacterial overexpression systems. The labeling of mammalian proteins, however, demands a different strategy since mammalian cells lack a biosynthetic pathway for isoleucine. 3-Methyl-2-oxopentanoate is the corresponding α-ketoacid of isoleucine and represents a possible precursor for selective labeling in mammalian overexpression systems. As the first intermediate of isoleucine degradation and the product of a reversible transamination, this compound can be converted back into the target amino acid in vivo. This project aims to develop a synthetic route for an isotopologue of 3-methyl-2-oxopentanoate containing a protonated δ-13CH3 group in an otherwise deuterated side chain. Furthermore, it needs to be proven whether the selected precursor can be effectively incorporated into proteins by utilizing a transaminase-catalyzed in vivo conversion to the corresponding target amino acid. For selective histidine labeling, a similar approach was envisioned. Lichtenecker et al. introduced 2-hydroxy-3-(1H-imidazol-4-yl) acrylic acid as a suitable precursor for efficient histidine labeling in E. coli overexpression systems. This compound is an enol tautomer of the histidine degradation product imidazole-4-pyruvate, and selectively converted into the target residue by taking advantage of the reversible nature of the corresponding transaminase activity. In this case, the objective is to synthesize different isotopologues of the previously described precursor containing distinct spin systems, namely 1H-13C, 1H-15N, or 13C-15N. Depending on the labeling pattern, different NMR applications can be envisaged to obtain information about protein structure, dynamics and interaction.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Isotopenmarkierung Organische Chemie Protein-NMR-Spektroskopie Selektive Seitenkettenmarkierung Histidin- und Isoleucin-Markierung Isotopenmarkierte Aminosäurevorstufen
Schlagwörter
(Englisch)
Isotope labeling Organic chemistry Protein NMR spectroscopy Selective side-chain labeling Histidine and isoleucine labeling Isotope-labeled amino acid precursors
Autor*innen
Alisa Wimmer 
Haupttitel (Englisch)
Synthesis of stable isotope-labeled histidine and isoleucine precursors for protein and peptide NMR investigation
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
vi, 102 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Roman Lichtenecker
Klassifikation
35 Chemie > 35.52 Präparative Organische Chemie
AC Nummer
AC17799042
Utheses ID
79445
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |