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Optimization of purification methods for PEGylated-polymer conjugates
Akinalp Ismet Saglam
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Pharmazie
Betreuer*in
Manfred Ogris
Mitbetreuer*in
Haider Sami
DOI
10.25365/thesis.80418
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-10831.85559.747795-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Krebsbehandlung ist nach wie vor einer der anspruchsvollsten Bereiche der biomedizinischen Forschung und hat angesichts der wachsenden Zahl von Patienten, die wirksame Therapien benötigen, eine erhebliche gesellschaftliche Relevanz. Über die konventionellen Behandlungsmethoden hinaus hat die Krebsforschung innovative therapeutische Strategien vorangetrieben, darunter Immuntherapien und genbasierte Ansätze. In diesem Zusammenhang haben sich Gentherapie und mRNA-Technologien als vielseitige Plattformen für die Entwicklung neuartiger Behandlungen herausgestellt. Die intrinsischen physikalisch-chemischen Eigenschaften von mRNA stellen jedoch erhebliche Herausforderungen für eine effiziente und gezielte Verabreichung dar, sodass der Einsatz spezieller Wirkstofffreisetzungssysteme wie polymerbasierter Träger erforderlich ist. PEGyliertes lineares Polyethylenimin (LPEI) stellt, wenn es mit Zielmolekülen weiter funktionalisiert wird, um LPEI-PEG-Tri-Konjugate zu bilden, ein vielversprechendes Trägersystem für die gezielte In-vivo-Verabreichung von Nukleinsäuren dar. Der Synthesevorgang und insbesondere die nachgeschaltete Reinigungsstrategie spielen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Qualität, Reproduzierbarkeit und Funktionsleistung dieser polymeren Konjugate. Das primäre Ziel dieser Studie war die Optimierung der Synthese und Reinigung von LPEI10kDa-PEG2k-basierten Tri-Konjugaten. Die Tri-Konjugat-Synthese umfasste die anfängliche Konjugation von LPEI (10 kDa) mit einem heterobifunktionellen PEG2k-Linker zur Bildung eines LPEI10kDa-PEG2k-OPSS-Bi-Konjugats, gefolgt von einer Reinigung mittels Kationenaustauschchromatographie und Entsalzung entweder durch Zentrifugalfiltration oder Dialyse. Das gereinigte Bi-Konjugat wurde anschließend mit Cystein zur Reaktion gebracht, um das entsprechende Tri-Konjugat zu erzeugen, welches erneut chromatographisch gereinigt und entweder durch Zentrifugalfiltration oder Dialyse entsalzt wurden. Ein zentraler Schwerpunkt dieser Arbeit war die Optimierung von Reinigungsstrategien für LPEI10kDa-basierte Bi- und Tri-Konjugate durch eine vergleichende Bewertung von Zentrifugalfiltration und Dialyse. Dieser Vergleich zeigte, dass die Dialyse hinsichtlich der Entsalzungseffizienz und der Gesamtausbeute überlegen war, während die Zentrifugalfiltration eine deutlich höhere Zeiteffizienz bot und zu höheren OPSS/CYS-zu-LPEI-Molverhältnissen führte. Zur Unterstützung dieser Optimierung wurde die LPEI-Quantifizierung unter Verwendung einer kupferbasierten Analyse systematisch hinsichtlich der Haltbarkeit der Reagenzien, der Analysen-Variabilität und des Polymer- oder Konjugatverlusts während der Reinigung bewertet. Die Haltbarkeit der Reagenzien wurde auf 41 Tage festgelegt. Die Analysen-Variabilität lag zwischen 2 und 18 % und sank bei allen Verdünnungen unter 7%, wenn die Reagenzienkonzentrationen 30 µg/ml überschritten. Dies deutet darauf hin, dass zur Verringerung der Variabilität der Kupfer-Analysen-Ergebnisse eine Standardkurve mit Verdünnungen über 30 μg/ml verwendet werden sollte. In Bezug auf den Konjugatverlust während der Reinigung führte eine höhere Verdünnung vor der Kationenaustauschchromatographie zu einem geringeren Ertragsverlust. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde ein einziger Zentrifugalfiltrationsschritt als Standardverfahren zur Entsalzung ausgewählt. Mit diesem Ansatz wurde eine ausreichende Salz Entfernung bei akzeptablem Ertrag und reduzierter Verarbeitungszeit im Vergleich zu einem Waschprotokoll mit fünf Zyklen erreicht, das etwa eine zusätzliche Stunde erforderte. Zusätzlich wurden im Rahmen der Charakterisierung und als erster Anwendungsversuch dynamische Lichtstreuungsmessungen mit pDNA- und mRNA-basierten Polyplexen aus reinem LPEI sowie dem synthetisierten Tri-Konjugat durchgeführt, um Partikelgröße und Homogenität zu vergleichen.
Abstract
(Englisch)
Cancer treatment remains one of the most challenging areas of biomedical research, with substantial societal relevance given the growing number of patients requiring effective therapies. Beyond conventional treatment modalities, cancer research has advanced innovative therapeutic strategies, including immunotherapy and gene-based approaches. In this context, gene therapy and mRNA technologies have emerged as versatile platforms for the development of novel treatments. However, the intrinsic physicochemical properties of mRNA pose significant challenges for efficient and targeted delivery, necessitating the use of specialized drug delivery systems such as polymer-based carriers. PEGylated linear polyethylenimine (LPEI), when further functionalized with targeting moieties to form LPEI-PEG tri-conjugates, represents a promising carrier system for the targeted in vivo delivery of nucleic acids. The synthesis process, and in particular the downstream purification strategy, plays a critical role in determining the quality, reproducibility, and functional performance of these polymeric conjugates. The primary objective of this study was to optimize the synthesis and purification of LPEI10kDa-PEG2k-based tri-conjugates. Tri-conjugate synthesis involved the initial conjugation of LPEI (10 kDa) to a heterobifunctional PEG2k linker to form an LPEI10kDa-PEG2k-OPSS bi-conjugate, followed by purification via cation-exchange chromatography and desalting either via centrifugal filtration or dialysis. The purified bi-conjugate was subsequently reacted with cysteine to generate the corresponding tri-conjugate, which was again purified chromatographically and desalted either via centrifugal filtration or dialysis. A central focus of this work was the optimization of purification strategies for LPEI10kDa-based bi- and tri-conjugates through a comparative evaluation of centrifugal filtration and dialysis. This comparison demonstrated that dialysis was superior with respect to desalting efficiency and overall yield, whereas centrifugal filtration offered significantly higher time Efficiency and resulted in higher OPSS/CYS-to-LPEI molar ratios. To support this optimization, LPEI quantification using a copper-based assay was systematically evaluated with respect to reagent shelf-life, assay variability, and polymer or conjugate loss during purification. The reagent shelf life was determined to be 41 days. Assay variability ranged from 2-18% and decreased to below 7% across all dilutions when reagent concentrations exceeded 30 µg/mL. This suggests that in order to reduce variability in the copper assay results, a standard curve with dilutions above 30 μg/mL should be utilized. With regard to conjugate loss during purification, higher dilution prior to cation-exchange chromatography resulted in reduced yield loss. Based on these findings, a single centrifugal filtration step was selected as the standard desalting procedure. This approach achieved adequate salt removal while preserving acceptable yield and reduced processing time relative to a five-cycle washing protocol, which required approximately one additional hour. Additionally, as part of the characterization and as an initial application trial, dynamic light scattering measurements were performed using both pDNA-and mRNA-based polyplexes with sole LPEI and the synthesized tri-conjugate to compare particle size and homogeneity.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Polymerkonjugate Aufreinigung PEGylierte Konjugate
Schlagwörter
(Englisch)
Polymer conjugates Purification PEGylated conjugates
Autor*innen
Akinalp Ismet Saglam
Haupttitel (Englisch)
Optimization of purification methods for PEGylated-polymer conjugates
Paralleltitel (Deutsch)
Optimierung von Aufreinigungsmethoden für PEGylierte-Polymerkonjugate
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
65 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Manfred Ogris
Klassifikation
44 Medizin > 44.40 Pharmazie. Pharmazeutika
AC Nummer
AC17784936
Utheses ID
79541
Studienkennzahl
UA | 066 | 605 | |