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Development of combinatorially-multiplexed DNA-PAINT and application to super-resolved RNA-FISH imaging
Alessandro Passera
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium Molecular Biosciences Molekulare Biologie
Betreuer*in
Francisco Balzarotti
DOI
10.25365/thesis.81072
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-21937.79827.438771-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Messenger-RNA (mRNA) ist ein biologisches Polymer von zentraler Bedeutung für die Zellbiologie, da es Informationen von der DNA im Zellkern an die Proteinproduktionsmaschinerie im Zytoplasma weiterleitet. Es ist bekannt, dass mRNA zusammen mit zahlreichen Proteinpartnern Komplexe bildet, die als Ribonukleoprotein (RNP)-Partikel bezeichnet werden, und dass die spezifische Zusammensetzung von mRNPs tiefgreifende Auswirkungen auf die Stabilität, den Transport im Zellkern, den Export und die Translation von mRNA hat. Trotz aller Erkenntnisse über die Struktur und Rolle der Proteinkomponente von mRNPs ist über die Ultrastruktur der darin enthaltenen mRNA nur wenig bekannt. In dieser Arbeit stelle ich Werkzeuge für die multiplexierte optische Nanoskopie vor, insbesondere für Szenarien mit niedrigem Signal-Hintergrund-Verhältnis (SBR), wie z. B. im Zellkern, und wende sie auf die Bildgebung von zellulärer mRNA an. Dazu trage ich zunächst zur Entwicklung und Validierung eines verbesserten MINFLUX-Mikroskops bei, das unter anderem besonders für die Bildgebung mit niedrigem SBR geeignet ist. Anschließend zeige ich die Entwicklung einer Multiplexing-Methode, die auf Signalkombinationen basiert, um eine DNA-PAINT-Bildgebung mit hoher Zielanzahl durchzuführen. Mit dieser Methode sind im Vergleich zu herkömmlichem DNA-PAINT weniger Bildgebungsschritte erforderlich, um eine bestimmte Anzahl von Zielen abzubilden, was die Bildgebung beschleunigt und vereinfacht. Durch die Kombination von optimierter RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) mit kombinatorischem DNA-PAINT zeige ich die multiplexe Bildgebung mehrerer Regionen mehrerer mRNAs von Interesse in Säugetierzellen und extrahiere geometrische Merkmale dieser Partikel im Zellkern und Zytoplasma. mRNAs scheinen im Zellkern in Abhängigkeit von der Intron-Dichte verdichtet zu sein und nehmen insgesamt längliche und oft nicht-konvexe Formen an. Schließlich verwende ich das zuvor entwickelte MINFLUX-Mikroskop, um die ersten 3D-MINFLUX-RNA-FISH-Bilder von nukleären und zytoplasmatischen mRNAs zu erhalten. Diese Werkzeuge ermöglichen insbesondere die Untersuchung der mRNA-Ultrastruktur und vereinfachen allgemein die multiplexe DNA-PAINT-Bildgebung – Fortschritte, von denen ich hoffe, dass sie von der Bildgebungsgemeinschaft übernommen werden.
Abstract
(Englisch)
Messenger RNA (mRNA) is a biological polymer of central importance for cell biology, as it transfers information from DNA in the nucleus to the protein-making machinery in the cytoplasm. It is established that mRNA forms complexes called ribonucleoprotein (RNP) particles together with numerous protein partners and that the specific composition of mRNPs has profound consequences on mRNA’s stability, nuclear transport, export, and translation. However, for all that is known on the structure and role of the protein component of mRNPs, little is known on the ultrastructure of the mRNA they contain. In this thesis, I provide tools for multiplexed optical nanoscopy, especially in low signal-to-background (SBR) scenarios, like the cell nucleus, and apply them to the imaging of cellular mRNA. To do this, I first contribute to developing and validating an improved MINFLUX microscope, which among other things is particularly adept at low SBR imaging. I then show the development of a multiplexing method based on combinations of signals to perform high-target number DNA-PAINT imaging. Using this method, a lower number of imaging steps is required to image a given number of targets compared to conventional DNA-PAINT, speeding up and simplifying imaging. Combining optimized RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) with combinatorial DNA-PAINT, I show the multiplexed imaging of multiple regions of several mRNAs of interest in mammalian cells, extracting geometric features of these particles in the nucleus and cytoplasm. mRNAs appear to be compacted in an intron density-dependent manner in the nucleus, and they overall assume elongated and often non-convex shapes. Finally, I use the MINFLUX microscope previously developed to obtain the first 3D MINFLUX RNA-FISH images of nuclear and cytoplasmic mRNAs. These tools allow the study of mRNA ultrastructure in particular and simplify multiplexed DNA-PAINT imaging in general — advances I hope will be adopted by the imaging community.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Superresolution Mikroskopie mRNA
Schlagwörter
(Englisch)
Superresolution Microscopy mRNA
Autor*innen
Alessandro Passera 
Haupttitel (Englisch)
Development of combinatorially-multiplexed DNA-PAINT and application to super-resolved RNA-FISH imaging
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
128 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Anton Goloborodko ,
Sabrina Simoncelli
Klassifikationen
42 Biologie > 42.12 Biophysik ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC17884709
Utheses ID
79712
Studienkennzahl
UA | 794 | 620 | 490 |