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Towards a robust and efficient protocol optimizing the generation of stable transgenic HvTol single knock-out barley plants using CRISPR/Cas9
Moritz Schmid
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Botany
Betreuer*in
Verena Ibl
DOI
10.25365/thesis.80808
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-23917.06557.727259-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die vorliegende Arbeit zielte darauf ab, eine vollständige Agrobacterium-vermittelte Transformationspipeline für Gerste (cv. Golden Promise) zu optimieren, um dabei stabile CRISPR/Cas9-Knockout-Linien für einzelne HvTol-Gene zu erzeugen. Die TOL-Proteinfamilie fungiert als funktionelles Äquivalent von ESCRT-0 in der endosomalen Sortierung und spielt eine wichtige Rolle während der Kornentwicklung, wobei die spezifischen Funktionen der einzelnen Familienmitglieder in Gerste weitgehend unbekannt sind. Insgesamt wurden vier CRISPR/Cas9-Konstrukte (pHUE411-HvTol1, -HvTol2, -HvTol3, -HvTol8) mittels Golden Gate-Klonierung erfolgreich generiert und durch Restriktionsanalyse sowie Sangersequenzierung validiert. Bei der Validierung dieser Konstrukte in transienten Transformationsexperimenten in Nicotiana tabacum konnte diesen dabei keine Aktivität anhand einer signifikanten Reduktion der GFP-Fluoreszenz zugesprochen werden. Dies ist vermutlich in einer unzureichenden Aktivität der expressionssteuernden monokotyledonen Promotoren in einem dikotyledonen Wirt begründet und konnte nicht auf eine unzureichende Funktion des CRISPR-Systems zurückgeführt werden. Die stabile Transformation wurde über mehrere experimentelle Durchläufe etabliert, von denen die zwei erfolgreichsten hier dargestellt werden und erzielten mehrere methodische Fortschritte: die eingeführte Timentin-Behandlung eliminierte Agrobacterium-Überwuchs effektiv, und modifiziertes Transitionsmedium (TM2) verbesserte die Sprossregeneration deutlich gegenüber dem ursprünglichen TM-Medium. Zum ersten Mal wurden in diesem Labor Gerstenpflanzen erfolgreich aus Gewebekultur bis zur Bodenkultur regeneriert. PCR-Screening aller Regeneranten ergab jedoch keine Nachweise für stabile Transgen-Integration. Mehrere Faktoren wurden dabei als Ursachen identifiziert: zum einen die Verwendung des nicht-hypervirulenten Agrobacterium-Stammes GV3101 anstelle von AGL1, zum anderen überdimensionierte Embryonen (3.0–3.5 mm statt 1.5–2.0 mm), zusätzlich wurde die Hygromycin-Aktivität durch wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen kompromittiert, wodurch die Selektion in späteren Regenerationsstadien ausblieb. Trotz alledem liefert diese Arbeit eine funktionale Transformationspipeline mit klar identifizierten Optimierungspunkten für zukünftige Experimente, einschließlich der Verwendung von AGL1, strenger Embryogrößenselektion, frisch aliquotiertem Hygromycin und kontinuierlicher Selektion während aller Kulturstadien, sowie den erarbeiteten methodischen Fortschritten.
Abstract
(Englisch)
This study aimed to optimize a complete Agrobacterium-mediated transformation pipeline for barley (cv. Golden Promise) to generate stable CRISPR/Cas9 knockout lines targeting individual HvTol genes. The TOL protein family functions as the plant equivalent of ESCRT-0 in endosomal sorting and plays an important role during grain development, yet the specific contributions of individual family members remain largely unknown. A total of four CRISPR/Cas9 constructs (pHUE411-HvTol1, -HvTol2, -HvTol3, -HvTol8) were successfully generated via Golden Gate cloning and validated by restriction analysis and Sanger sequencing. When validated in transient transformation experiments in Nicotiana tabacum, no activity could be attributed to these constructs based on GFP fluorescence reduction, likely due to insufficient activity of monocot-derived promoters in the dicot host, rather than insufficient function of the CRISPR system itself. Stable transformation was established over several experimental runs, the two most successful of which are presented here, achieving several methodological advances: timentin treatment effectively eliminated Agrobacterium overgrowth, and modified transition medium (TM2) substantially improved shoot regeneration compared to the original TM formulation. For the first time in this laboratory, barley plants were successfully regenerated from tissue culture to soil. However, PCR screening of all regenerants revealed no evidence of stable transgene integration. Several contributing factors were identified: (i) use of the non-hypervirulent Agrobacterium strain GV3101 instead of AGL1, (ii) oversized embryos (3.0–3.5 mm instead of 1.5–2.0 mm), (iii) compromised hygromycin activity due to repeated freeze-thaw cycles, and (iv) removal of selection during later regeneration stages. This work provides a functional transformation pipeline with clearly identified optimization points for future experiments, including the adoption of AGL1, strict embryo size selection, freshly aliquoted hygromycin, and continuous selection throughout all culture stages, as well as the methodological advances established herein.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Gerste Gerstentransformation Gewebekultur HvTOL ESCRT CRISPR Stabile Transformation von Gersten Embryos Gersten Embryos Hordeum vulgare Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation Pflanzengewebekultur Molekularbiologie der Pflanzen
Schlagwörter
(Englisch)
Barley Barley transformation tissue culture HvTOL ESCRT CRISPR stable transformation of barley embryos barley embryos Hordeum vulgare Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation plant tissue culture plant molecular biology
Autor*innen
Moritz Schmid
Haupttitel (Englisch)
Towards a robust and efficient protocol optimizing the generation of stable transgenic HvTol single knock-out barley plants using CRISPR/Cas9
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
129 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Verena Ibl
AC Nummer
AC17827243
Utheses ID
80117
Studienkennzahl
UA | 066 | 832 | |