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Detection and quantification of environmental chlamydiae and their hosts using digital droplet PCR and fluorescence-activated cell sorting
Lena Rohrhofer
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Mikrobiologie und Umweltsystemwissenschaft
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molecular Microbiology, Microbial Ecology and Immunobiology
Betreuer*in
Matthias Horn
DOI
10.25365/thesis.80911
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-26400.95510.786399-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Es ist mittlerweile gut belegt, dass freilebende Amöben als Wirte für eine Vielzahl unterschiedlicher Mikroorganismen, einschließlich zahlreicher Krankheitserreger, fungieren. Mitglieder des Phylums Chlamydiota zählen zu den bedeutendsten bakteriellen Endosymbionten dieser Eukaryoten. Trotz ihres weltweiten Vorkommens in verschiedensten Wirten – von Amöben über andere Protisten bis hin zu den bekannten humanpathogenen Vertretern Chlamydia trachomatis und Chlamydophila pneumoniae – sind viele Aspekte von Umweltchlamydien bislang unzureichend erforscht. Insbesondere Fakten über ihre Abundanz in natürlichen Habitaten und ihre Kultivierbarkeit stellen nach wie vor zentrale Wissenslücken dar. Ziel dieser Arbeit war es daher, methodische Ansätze zu entwickeln und zu optimieren, die 1.) eine schnelle und präzise Quantifizierung sowie 2.) einen gezielten Nachweis und potenziell auch die Kultivierung von Umweltchlamydien ermöglichen, um so zu einem tieferen Verständnis dieser Bakterien beizutragen. Als Modell wurden Protochlamydia amoebophila in Symbiose mit Acanthamoeba castellanii kultiviert. Darauf aufbauend wurden verschiedene Verfahren zur Zellfärbung und Zellsortierung evaluiert sowie ein Protokoll zur Quantifizierung von Chlamydien in Umweltproben mittels digitaler Tröpfchen-PCR (digital droplet PCR, ddPCR) etabliert. Die ddPCR, welche eine absolute Quantifizierung erlaubt, erwies sich als vielversprechende Methode für einen umfassenderen Nachweis von Chlamydiae in Umweltproben. Sie bietet gegenüber herkömmlichen Verfahren den Vorteil einer höheren Nachweisempfindlichkeit insbesondere für seltene Sequenzen und niedriger Gen Kopien und ist zudem weniger anfällig für Inhibitoren und unspezifische Signale. Ergänzend wurden verschiedene Färbemethoden getestet, darunter FISH in Suspension, die Färbung von Nukleinsäuren mittels DAPI und SYTO™9, die Lysosomenmarker LysoTracker™ Red und Yellow sowie die fluoreszierenden D-Aminosäuren (FDAAs) HADA und BADA. Diese Färbeverfahren wurden hinsichtlich ihrer Eignung zur Identifikation von Chlamydiae-infizierten Protisten aus Umweltproben in Kombination mit einem BD FACSMelody™-Zellsortierer untersucht. Ein robustes ddPCR-Protokoll zur exakten Quantifizierung von P. amoebophila wurde erfolgreich etabliert und erfolgreich mit Umweltproben getestet. Darüber hinaus wurde ein effizientes FISH-in-Suspension-Protokoll speziell für mit P. amoebophila infizierte A. castellanii entwickelt, das auch für FACS-gestützte Analysen geeignet ist. Die Evaluierung der Färbemethoden zeigte, dass einzelne Ansätze in der Regel erfolgreich waren, während sich kombinierte Anwendungen des Öfteren gegenseitig inhibierten. In ersten Versuchen konnten aus Umweltproben, die mittels FISH in Suspension und FACS sortiert wurden, auch Protisten erfolgreich kultiviert werden und mittels Sequenzierung charakterisiert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sowohl ddPCR als auch FACS-basierte Nachweisstrategien bereits praxistauglich sind und ein hohes Potenzial für weiterführende Untersuchungen von Chlamydien in der Umwelt besitzen.
Abstract
(Englisch)
Ubiquitous amoebas are hosts to many different bacterial symbionts and pathogens. One of the most prominent examples is bacteria belonging to the Chlamydiota phylum. But despite their global success by thriving riving not only in amoeba but in a variety of eukaryotic hosts - ranging from protists to diverse animals - environmental chlamydiae are still poorly understood in many aspects. We still lack knowledge about their global abundance, metabolisms or symbiotic interactions. Therefore, in this study methodological approaches were explored that may enable 1) a quick and easy quantification, and 2) a targeted detection and isolation of environmental chlamydiae together with their protist hosts. For this purpose, the well-established Acanthamoeba castellanii infected with Protochlamydia amoebophila were used as main representatives to successfully establish a protocol for quantifying chlamydiae from environmental samples using digital droplet PCR (ddPCR). Further, an efficient protocol for fluorescence in situ hybridization in suspension (liquid FISH), specifically targeting Acanthamoeba infected with Protochlamydia, was established and applied to test various approaches for cell staining, like, nucleic acid stains, fluorescently labelled amino acids (FDAAs) or LysoTrackerTM, in combination with cell sorting via fluorescence-activated cell sorting (FACS). While most staining methods performed well individually, they often interfered with each other when combined. Yet, several environmental protists FACS sorted via FISH in suspension were successfully cultivated and subsequently sequenced. Therefore, this study shows that both approaches, ddPCR and FACS in combination with liquid FISH are well applicable and holds potential for exploring the globally abundant environmental chlamydiae in diverse environments.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Umweltchlamydien Protochlamydia amoebophila Acanthamoeba castellanii FACS ddPCR
Schlagwörter
(Englisch)
environmental chlamydiae Protochlamydia amoebophila Acanthamoeba castellanii FACS ddPCR
Autor*innen
Lena Rohrhofer
Haupttitel (Englisch)
Detection and quantification of environmental chlamydiae and their hosts using digital droplet PCR and fluorescence-activated cell sorting
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
83 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Matthias Horn
Klassifikation
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
AC Nummer
AC17836269
Utheses ID
80194
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |