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Development of a method to assess the redox proteome
Valentina Heuschneider
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Chemie
Betreuer*in
Samuel Meier-Menches
DOI
10.25365/thesis.81015
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-17994.11423.398697-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine zentrale Rolle in zellulären Redoxprozessen. Während kontrollierte ROS-Konzentrationen an physiologischen Signalprozessen beteiligt sind, führt eine übermäßige ROS-Bildung zur Störung der Redoxhomöostase und zu oxidativem Stress, der mit zellulärer Dysfunktion und Schädigung einhergeht. Ein zentraler Mechanismus der Redoxsignalübertragung beruht auf reversiblen oxidativen posttranslationalen Modifikationen (oxPTMs) an Cysteinresten in Proteinen. Aufgrund der hohen Reaktivität von Cystein-Thiolgruppen sind diese besonders anfällig für oxidative Modifikationen, die als regulatorische Redox-Schalter fungieren können und dadurch Proteinaktivität, Struktur und Interaktionen modulieren. Eine umfassende Charakterisierung der Redoxzustände von Cysteinen ist daher entscheidend für das Verständnis redoxabhängiger zellulärer Regulationsmechanismen. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Anwendung eines massenspektrometriebasierten Redox-Proteomik-Workflows zur Analyse cysteinspezifischer Modifikationen in zellulären Systemen sowie dessen Bewertung hinsichtlich der Erfassbarkeit des zellulären Redoxproteoms unter definierten experimentellen Bedingungen. Hierzu wurde eine Differentialalkylierungsstrategie unter Verwendung von N-Ethylmaleimid (NEM) und isotopenmarkiertem d5-NEM etabliert, die eine Unterscheidung zwischen reduzierten und reversibel oxidierten Cysteinresten innerhalb eines Bottom-up-Proteomik-Ansatzes ermöglicht. Der entwickelte Workflow wurde zunächst anhand einer definierten Proteinmischung validiert, um Markierungseffizienz, Spezifität und technische Robustheit zu beurteilen, und anschließend auf SW480-Kolonkarzinomzellen sowie Detroit-551-Fibroblasten angewendet. Oxidativer Stress wurde durch tert-Butylhydroperoxid (TBHP) und Arsentrioxid (ATO) induziert. Nach der Behandlung wurden die Gesamtzelllysate differentiell alkyliert, enzymatisch verdaut und anschließend mittels Nano-Flüssigchromatographie gekoppelt an Tandem-Massenspektrometrie (NanoLC-MS/MS) auf einem timsTOF Pro analysiert. Die proteomweite Analyse zeigte behandlungsabhängige Unterschiede in der zellulären Antwort auf oxidative Perturbationen. Während die Behandlung mit TBHP unter den getesteten Bedingungen nur geringe proteomische Veränderungen zeigte, führte die Behandlung mit ATO zu signifikanten Veränderungen der Proteinabundanz. Peptidbasierte Analysen ermöglichten die gleichzeitige Untersuchung von Cystein-Redoxzuständen und Veränderungen der Proteinabundanz und zeigten, dass Redoxregulation in hohem Maße positionsspezifisch erfolgt und nicht durch eine gleichmäßige Oxidation des gesamten Proteoms beschrieben werden kann. Durch die kombinierte Analyse auf Protein- und Peptidebene der ATO-Behandlung wurde die Überlappung zwischen signifikant regulierten Proteinen und ATO-spezifischen unique Peptiden untersucht, woraus Hitzeschockproteine sowie Komponenten des Pentosephosphatwegs für eine detaillierte Redoxcharakterisierung ausgewählt wurden. Insgesamt etabliert und bewertet diese Arbeit einen auf Differentialalkylierung basierenden Redox-Proteomik-Workflow, der mit globalen Proteomanalysen kompatibel ist, und demonstriert dessen Anwendbarkeit zur Untersuchung cysteinzentrierter Redoxregulation in zellulären Systemen. Der Ansatz ermöglicht die Verknüpfung cysteinspezifischer Redoxmodifikationen mit funktionellen zellulären Antworten auf oxidativen Stress.
Abstract
(Englisch)
Reactive oxygen species (ROS) play a central role in cellular redox processes. While controlled ROS levels participate in physiological signaling, excessive ROS generation disrupts redox homeostasis and leads to oxidative stress associated with cellular dysfunction and damage. A major mechanism through which redox signals are transmitted involves reversible oxidative post-translational modifications (oxPTMs) of cysteine residues in proteins. Due to the high reactivity of cysteine thiol groups, these residues are particularly susceptible to oxidative modifications, which can function as regulatory redox switches that modulate protein activity, structure, and interactions. Comprehensive characterization of cysteine redox states is therefore essential for understanding redox-dependent cellular regulation. The aim of this thesis was to develop, apply, and evaluate a mass spectrometry-based redox proteomics workflow to characterize cysteine-specific modifications in cellular systems and to assess how comprehensively the cellular redox proteome can be captured under defined experimental conditions. A differential alkylation strategy using N-ethylmaleimide (NEM) and isotopically labeled d5-NEM was established to distinguish between reduced and reversibly oxidized cysteine residues within a bottom-up proteomics workflow. The workflow was first validated using a defined protein mixture to assess labeling efficiency, specificity, and technical robustness, and was subsequently applied to SW480 colon carcinoma cells and Detroit 551 fibroblasts. Oxidative stress was induced using tert-butyl hydroperoxide (TBHP) and arsenic trioxide (ATO). Following treatment, whole cell lysates were subjected to differential alkylation, enzymatic digestion, and nano liquid chromatography-tandem mass spectrometry (nanoLC-MS/MS) analysis on a timsTOF Pro mass spectrometer. Proteome-wide profiling revealed treatment-dependent differences in the cellular response to oxidative perturbation. While TBHP treatment resulted in only limited proteomic alterations under the tested conditions, ATO treatment induced significant changes in protein abundance. Peptide-level analyses enabled the simultaneous assessment of cysteine redox states and protein abundance changes, indicating that redox regulation occurs in a highly site-specific manner rather than through uniform oxidation across the proteome. Combined analysis of protein- and peptide-level data examined the overlap between significantly regulated proteins and ATO-specific unique peptides, from which heat shock proteins and components of the pentose phosphate pathway were selected for detailed redox characterization. Overall, this work establishes and evaluates a differential alkylation-based redox proteomics workflow compatible with global proteome analysis and demonstrates its applicability for investigating cysteine-centered redox regulation in cellular systems. The approach provides a framework for linking cysteine-specific redox modifications with functional cellular responses to oxidative stress.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Massenspektrometrie Proteomics Redox Proteomics tert-Butylhydroperoxid TBHP Zellkultur SW480 Detroit 551 Arsentrioxid Cystein Differentielle Alkylierung
Autor*innen
Valentina Heuschneider
Haupttitel (Englisch)
Development of a method to assess the redox proteome
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
VII, 67 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Samuel Meier-Menches
Klassifikation
35 Chemie > 35.26 Massenspektrometrie
AC Nummer
AC17850311
Utheses ID
80433
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |