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HRM and pyrosequencing-based identification of Apis mellifera carnica mtDNA in honey for product authentication and subspecies conservation
Andrea Bevilacqua
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Lebensmittelchemie
Betreuer*in
Margit Cichna-Markl
DOI
10.25365/thesis.80976
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-20820.18932.926545-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Honig ist anfällig für Betrug, einschließlich falscher Herkunftsangaben. Da Honig Umwelt-DNA (eDNA) enthält, können molekulare Ansätze zur Überprüfung seiner Authentizität eingesetzt werden. Insbesondere liefert aus Honig gewonnene DNA von Apis mellifera Informationen über die entomologische Quelle des Produkts, kann indirekt auf die geografische Herkunft hinweisen und ist für den Schutz einheimischer Honigbienen-Unterarten relevant. Mitochondriale DNA (mtDNA) eignet sich besonders für diesen Zweck aufgrund ihrer hohen Kopienzahl, Stabilität, maternalen Vererbung und hohen Mutationsrate. Ziel dieser Studie war die Entwicklung einer Methode zur Identifizierung von A. mellifera Unterarten in Honig, mit besonderem Fokus auf A. m. carnica, einer in Österreich heimischen und in vier Bundesländern geschützten Unterart. Honigproben wurden ausgewählt, um unterschiedliche geografische Herkunftsgebiete und Unterartenverteilungen abzudecken, mit Schwerpunkt auf österreichischen Honigen sowie relevanten europäischen und außer europäischen Proben. Auch einzelne Bienen wurden für die Analyse gesammelt und als Referenz verwendet. Die DNA-Extraktion wurde sowohl für Honig- als auch für Bienenproben optimiert, einschließlich der alpinen und pannonischen Variante von A. m. carnica. Anschließend wurden hochvariable mtDNA-Regionen untersucht. Im ND4-Gen wurde eine Region mit sechs diagnostischen SNPs identifiziert, die mit einem neu entwickelten Assay (BEE 3_2), unter Verwendung eines biotinylierten Reverse-Primers für die Pyrosequenzierung (PSQ) gezielt analysiert wurde. Es wurde eine real-time quantitative PCR (qPCR) gefolgt von einer High Resolution-Melting (HRM)-Analyse durchgeführt, wobei anschließend die PSQ zur Bestätigung der Ergebnisse und zur weiteren Differenzierung der Subspezies eingesetzt wurde. Mit dieser Methode allein konnte die alpine Variante von A. m. carnica von den anderen, in der europäischen Imkerei häufig verwendeten Unterarten unterschieden werden. Für die schwierigere Abgrenzung der pannonischen Variante von A. m. ligustica war hingegen die Entwicklung eines zweiten Assays (BEE 6), das auf einen einzelnen diagnostischen SNP abzielt, erforderlich. BEE 6 benötigt jedoch eine weitere Validierung. Der kombinierte HRM- und PSQ Ansatz unter Verwendung dieser beiden Assays zusammen mit einem weiteren, in unserer Arbeitsgruppe bereits etablierten Assay (BEE 2_1) zeigte vielversprechende Ergebnisse bei der Unterscheidung von Honigproben, die nur A. m. carnica-DNA (alpine, pannonische oder eine Mischung beider Varianten) enthalten, von Proben mit anderen Unterarten. Dieser Ansatz könnte somit zum Verbraucherschutz, zur Überprüfung der Honig-Authentizität, zur Bewertung der geografischen Herkunft sowie zur Erhaltung dieser geschützten Unterart beitragen.
Abstract
(Englisch)
Honey is susceptible to fraud, including false declarations of origin. Since honey contains environmental DNA (eDNA), molecular approaches can be used to assess its authenticity. In particular, Apis mellifera DNA recovered from honey provides information on the entomological source of the product, can indirectly indicate its geographic provenance, and is relevant for the protection of native honeybee subspecies. Mitochondrial DNA (mtDNA) is especially suitable for this purpose due to its high copy number, stability, maternal inheritance, and high mutation rate. This study aimed to develop a method to identify A. mellifera subspecies in honey, with particular focus on A. m. carnica, a subspecies native to Austria and protected in four Austrian federal states. Honey samples were selected to represent diverse geographic origins and subspecies distributions, focusing on Austrian honeys, as well as relevant European and non-European samples. Bee specimens were also collected for analysis and used as a reference. DNA extraction was optimized for both honey and bees, including the Alpine and Pannonian variant of A. m. carnica. Highly variable mtDNA regions were then investigated. In the ND4 gene, a region containing six diagnostic SNPs was identified and targeted using a newly designed assay (BEE 3_2), involving a biotinylated reverse primer to enable pyrosequencing (PSQ). Real-time quantitative PCR (qPCR) followed by high-resolution melting (HRM) analysis was conducted, with subsequent PSQ to confirm the results. Using this method alone, the Alpine variant of A. m. carnica could be distinguished from the other subspecies commonly used by European beekeepers. However, the development of a second assay (BEE 6), targeting a single diagnostic SNP, was necessary for the more challenging discrimination of the Pannonian variant from A. m. ligustica. Nevertheless, BEE 6 still requires further validation. The combined HRM and PSQ approach, using these two assays together with a third assay (BEE 2_1) already established in our research group, showed promising results in distinguishing honey containing only A. m. carnica DNA (Alpine, Pannonian, or a mixture of both) from samples containing other subspecies. This approach may therefore support consumer protection, verification of honey authenticity, assessment of geographic origin, and conservation of this protected subspecies.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Honig Honigfälschung Honig-Authentizität Herkunftsnachweis Rückverfolgbarkeit eDNA Umwelt-DNA Apis mellifera Carnica mtDNA SNP qPCR HRM Pyrosequencing genetische Analyse Unterarten Honigbiene Lebensmittelsicherheit Biodiversität
Schlagwörter
(Englisch)
honey honey fraud honey authenticity provenance traceability eDNA Apis mellifera carnica mtDNA SNP qPCR HRM pyrosequencing genetic analysis subspecies honey bee food safety biodiversity
Autor*innen
Andrea Bevilacqua
Haupttitel (Englisch)
HRM and pyrosequencing-based identification of Apis mellifera carnica mtDNA in honey for product authentication and subspecies conservation
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
V, 110 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Margit Cichna-Markl
Klassifikationen
35 Chemie > 35.23 Analytische Chemie. Allgemeines ,
35 Chemie > 35.65 Nukleinsäuren
AC Nummer
AC17848051
Utheses ID
80454
Studienkennzahl
UA | 066 | 659 | |