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Application of real-time PCR and high resolution melting (HRM) analysis for authentication of honey
Andrijana Marijan
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Chemie
Betreuer*in
Margit Cichna-Markl
DOI
10.25365/thesis.81014
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-24762.14012.176665-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Honig gilt als begehrter natürlicher Süßstoff, der wegen seiner geschmacklichen Eigenschaften und seiner positiven Auswirkungen auf die Gesundheit geschätzt wird, die von der Art der Pflanzen abhängen, aus denen er gewonnen wird. Sein hoher Marktpreis macht Honig zu einem attraktiven Ziel für Betrug. Honig kann mit billigeren Zuckersirupen (Reis, Mais, Rüben oder Zuckerrohr) verdünnt werden, ohne dass dies leicht zu erkennen ist. Honig ist auch besonders anfällig für falsche Kennzeichnung und Fälschung seiner geografischen und botanischen Herkunft. Daher sind zuverlässige Analysemethoden zur Honigauthentifizierung unerlässlich, um die Produktqualität und den Verbraucherschutz zu gewährleisten. Das Ziel dieser Studie war es, das Potenzial der real-time PCR in Kombination mit einer hochauflösenden Schmelzkurvenanalyse (HRM) für die Authentifizierung von Honig zu untersuchen, der in Österreich und anderen europäischen Ländern erhältlich ist. Unser Ansatz basierte auf der Amplifikation polymorpher Regionen (16S rDNA und COI) der Honigbiene Apis mellifera und der Pflanzen-DNA (rbcL und ITS2) mittels real-time PCR und der Unterscheidung von A. mellifera Unterarten bzw. Arten bei Pflanzen anhand der Unterschiede im Schmelzverhalten der Amplikons. Die DNA wurde unter Verwendung des Dneasy mericon Food Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Als Positivkontrollen wurde auch DNA aus Honigbienenproben extrahiert, die in Österreich, Nordmazedonien, Bosnien und Herzegowina und Kroatien gesammelt wurden, sowie aus Pflanzensamen und -blättern, die in Honig vorkommen können, darunter Mais und Reis, da diese häufig als Sirup Zusätze verwendet werden. Die extrahierte DNA wurde mit einem Qubit-Fluorimeter quantifiziert. Primer Paare für die Amplifikation von Honigbienen (A. mellifera) DNA und Pflanzen-DNA wurden der Literatur entnommen und in silico getestet. Bei Bedarf wurden die Primer modifiziert, um größere Ähnlichkeit der Annealing-Temperaturen und bessere HRM-Ergebnisse und zu erzielen. Da in verschiedenen Ländern unterschiedliche Unterarten der Honigbiene A. mellifera vorkommen, wurden die mit dem COI Assay erhaltenen PCR Produkte sequenziert, um SNPs in der amplifizierten Region zu detektieren. Die Pyrosequenzierung dieser Amplikons ermöglichte es, den Genotyp verschiedener Honigbienen spezifischen Schmelzprofilen zuzuordnen. Diese Methode wurde bereits auf 56 Honigproben aus Österreich und anderen europäischen Ländern angewandt. Zusätzlich wurden physikalisch-chemische Parameter bestimmt: der Wassergehalt wurde mittels Refraktometrie ermittelt und außerdem wurde die elektrische Leitfähigkeit gemessen. Darüber hinaus wurde eine NMR-Analyse von 20 ausgewählten Honigproben durchgeführt, um ihre chemische Zusammensetzung besser zu verstehen und mögliche Merkmale des NMR-Fingerabdrucks jeder Honigsorte zu identifizieren.
Abstract
(Englisch)
Honey is considered a prized natural sweetener, valued for its flavor qualities and beneficial effects on health, influenced by the type of plants from which it originates. Its high market price makes honey an attractive target for fraud. Honey can be diluted with cheaper sugar syrups (rice, corn, beet or cane) without being easily detected. Honey is also particularly susceptible to mislabeling and falsification of its geographical and botanical origin. Therefore, reliable analytical methods for honey authentication are essential to ensure product quality and consumer protection. The aim of this study was to investigate the potential of real-time PCR combined with high resolution melting (HRM) analysis for the authentication of honey available in Austria and other European countries. Our approach was based on amplifying polymorphic regions (16S rDNA and COI) of honeybee Apis mellifera and plant DNA (rbcL and ITS2) by real-time PCR, enabling the discrimination of A. mellifera subspecies and plant species through differences in the melting behavior of the amplicons. DNA was extracted using the Dneasy mericon Food Kit (Qiagen), according to the manufacturer's instructions. As positive controls, DNA was also extracted from honeybee specimens collected in Austria, Bosnia & Herzegovina, Croatia, and North Macedonia, and plant seeds and leaves that may be present in honey. The extracted DNA was quantified using a Qubit fluorimeter. Primer pairs for the DNA amplification of honeybee A. mellifera and plant DNA were taken from the literature and tested in silico. If required, primers were modified to achieve better similarity of annealing temperatures and HRM results. Since different subspecies of the honeybee A. mellifera occur in different countries, PCR products amplified with the assay targeting COI were sequenced to detect SNPs in the amplified region. Pyrosequencing of these amplicons made it possible to assign specific melting profiles to the genotypes of different honeybees. This method has already been applied to 56 honey samples from Austria and other European countries. In addition, physicochemical parameters were determined: water content by refractometry and electrical conductivity was also assessed. NMR analysis was also performed on 20 selected honey samples to better understand their chemical composition, and to identify possible characteristics of the NMR fingerprint of each honey type.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
real-time PCR Honigverfälschung Schmelzkurvenanalyse Pyrosequenzierung DNA-Extraktion Honigauthentifizierung HRM-Analyse High Resolution Melting
Schlagwörter
(Englisch)
real-time PCR Honey adulteration Melting curve analysis Pyrosequencing DNA extraction Honey authentication HRM analysis High Resolution Melting
Autor*innen
Andrijana Marijan
Haupttitel (Englisch)
Application of real-time PCR and high resolution melting (HRM) analysis for authentication of honey
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
viii, 95 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Margit Cichna-Markl
Klassifikation
35 Chemie > 35.23 Analytische Chemie. Allgemeines
AC Nummer
AC17850300
Utheses ID
80508
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |