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Genetic engineering of Methanothermobacter marburgensis for bioplastic production
Alex-Ionuț Totolici
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molecular Microbiology, Microbial Ecology and Immunobiology
Betreuer*in
Simon Karl-Maria Rasso Rittmann
DOI
10.25365/thesis.81113
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-19838.32763.324833-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
In dieser Arbeit wird eine thermophile Plattform zur Umwandlung von CO₂ in PHB etabliert, indem Methanothermobacter marburgensis genetisch so modifiziert wird, dass es einen thermostabilen PhaABC-Stoffwechselweg exprimiert, und drei Acetoacetyl-CoA-Reduktasen (PhaB) verglichen werden: Eine NADPH-abhängige PhaB aus Caldimonas thermodepolymerans (Ther), eine chimäre Variante, die so konstruiert wurde, dass sie NADH bevorzugt (Chim), und einen Kandidaten aus Caldichromatium japonicum, von dem angenommen wird, dass er NADH-abhängig ist (Jap). Das Ziel ist die Schaffung einer tragfähigen biotechnologischen Alternative für die nachhaltige und effiziente Produktion biologisch abbaubarer Kunststoffe. Enzymtests bestätigten die Cofaktorpräferenzen: PhaB(Ther) war mit NADPH hochaktiv (54,75 U mg-1), mit NADH jedoch nahezu inaktiv (0,09 U mg-1), PhaB(Jap) zeigte eine starke NADH-Aktivität (21,96 U mg-1; 8,07 U mg-1 mit NADPH), und PhaB(Chim) blieb trotz NADH-Präferenz inaktiv (0,67 U mg-1). Die Genomintegration von PhaABC und die Isolierung der Mutanten wurden durch Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion bestätigt, die auf den Verlust des Δhpt-Signatursignals und das Vorhandensein von Stoffwechselweg-Genen abzielten, wodurch stabile Stämme für die Phänotypisierung sichergestellt wurden. Unter H2/CO2 (4:1) bei 3 bar und 55 ºC zeigte die BODIPY-Färbung und Bildgebung durch Mikroskopie eine robuste intrazelluläre PHB-Akkumulation im M. m. Jap-Stamm, moderate und zellheterogene Signale in M. m. Ther sowie nur schwache Signale in M. m. Chim. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Abstimmung der PhaB-Cofaktorverwertung auf den Redoxstoffwechsel des Wirts (NADH) eine effektive thermophile PHB-Biosynthese ermöglicht, wobei sich M. m. Jap als vielversprechender Stamm für die thermophile PHA Produktion herauskristallisiert. Zwar müssen die PHB-Quantifizierung und die chemische Bestätigung mittels LC–MS noch bestätigt werden, doch positionieren diese Ergebnisse M. marburgensis als genetisch manipulierbare, thermostabile Lösung für nachhaltige Gas-zu-Kunststoff-Bioprozesse, was Anreize bietet für: (i) die Modellierung und Optimierung der Stoffwechselwege in Methanogenen; (ii) die Entwicklung neuer genetischer Werkzeuge für Methanogene; (iii) die Skalierung und die Entwicklung entprechender Bioprozesse.
Abstract
(Englisch)
This thesis establishes a thermophilic, CO2-to-PHB conversion platform by engineering Methanothermobacter marburgensis to express a thermostable PhaABC pathway and benchmarking three acetoacetyl-CoA reductases (PhaB): a NADPH-dependent PhaB from Caldimonas thermodepolymerans (Ther), a chimeric variant designed into preferring NADH (Chim), and a candidate from Caldichromatium japonicum hypothesized to be NADH dependent (Jap). The final goal is the creation of a viable biotechnologically alternative for sustainable and efficient biodegradable plastic production. Enzyme assays corroborated the cofactor preferences: PhaB(Ther) was highly active with NADPH (54.75 U mg-1) but nearly inactive with NADH (0.09 U mg-1), PhaB(Jap) showed strong NADH activity (21.96 U mg-1; 8.07 U mg-1 with NADPH), and PhaB(Chim) showed low-activity despite NADH preference (0.67 U mg-1). Genome integration of PhaABC and mutants isolation were confirmed by PCR strategies targeting Δhpt signature signal loss and pathway gene presence, ensuring stable strains for phenotyping. Under H2/CO2 (4:1) at 3 bar and 55 ºC, BODIPY imaging indicated robust intracellular PHB accumulation in the M. marburgensis Jap strain, moderate and cell-heterogeneous signals in M. m. Ther, and only faint signals in M. m. Chim. These results prove that aligning PhaB cofactor usage with the host’s redox metabolism (NADH) enables effective thermophilic PHB biosynthesis, with M. m. Jap emerging as the detected most promissing strain for PHA production. While PHB quantitation and chemical confirmation by LC–MS still need to be confirmed, these findings position M. marburgensis as a genetically tractable, thermostable solution for sustainable gas-to-plastic bioprocesses which motivate for: (i) modelling and optimization of the metabolic pathways in methanogens; (ii) development of new genetic tools for methanogens; (iii) scale-up and downstream bioprocess developments.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Archaea Methanogene Synthetische Biologie Genetisches System Bioplastik Anaerobe Mikrobiologie
Schlagwörter
(Englisch)
Archaea Methanogens Synthetic biology Genetic system Bioplastic Anaerobic Microbiology
Autor*innen
Alex-Ionuț Totolici 
Haupttitel (Englisch)
Genetic engineering of Methanothermobacter marburgensis for bioplastic production
Paralleltitel (Deutsch)
Gentechnische Veränderung von Methanothermobacter marburgensis zur Herstellung von Biokunststoffen
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
93 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Simon Karl-Maria Rasso Rittmann
Klassifikationen
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie ,
58 Chemische Technik > 58.30 Biotechnologie
AC Nummer
AC17888670
Utheses ID
80758
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |