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Means and modes of 26S proteasomal substrate degradation
regulation by ubiquitin chains and the endogenous factor PITHD1
Sascha Josef Amann
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium Molecular Biosciences Molekulare Biologie
Betreuer*in
David Haselbach
DOI
10.25365/thesis.82078
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29234.40534.712968-5
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der gezielte Proteinabbau durch das Ubiquitin Proteasom System (UPS) ist essenziell für eukaryotisches Leben und liegt Prozessen von der Zellzykluskontrolle bis zur zellulären Quieszenz zugrunde. Im Zentrum dieses Systems steht das 26S Proteasom, das ubiquitinierte Proteine erkennt und deren Entfaltung und Abbau katalysiert. Die strukturellen Grundlagen der Proteasomregulation, insbesondere der Substratauswahl und Inhibition, sind jedoch bislang nur unvollständig verstanden. In dieser Arbeit untersuche ich, wie das humane 26S Proteasom durch unterschiedliche Ubiquitinketten Architekturen und durch einen endogenen Inhibitor reguliert wird. Im ersten Teil dieser Arbeit nutzte ich kinetische Assays, um zu analysieren, wie das 26S Proteasom Substrate mit verschiedenen Ubiquitinkettentypen verarbeitet. K48 verknüpfte Ketten förderten einen effizienten Abbau, während K11/K48 verzweigte Ketten diesen weiter verstärkten. Mithilfe von cryoEM bestimmte ich, wie das Proteasom mit kanonischen K48 verknüpften Ubiquitinketten und mit K11/K48 verzweigten Ubiquitinketten interagiert. Die Strukturen zeigten, dass K48 verknüpfte Ketten eine unerwartete spiralförmige Konformation um das ubiquitininteragierende Motiv 1 (UIM1) des Rezeptors RPN10 einnehmen, während die K11 Verzweigung mit einer Lücke zwischen RPN10 und RPN2 interagiert. Strukturgeleitete Mutagenese und zelluläre Assays zeigten, dass diese topologiespezifischen Interaktionen für effizienten Proteinabbau und Zellwachstum erforderlich sind. Im zweiten Teil identifizierte ich PITHD1 als einen auf 26S Proteasomen in ruhenden Zebrafischeiern angereicherten Faktor. Mithilfe von cryoEM zeigte ich, dass PITHD1 an das 19S Regulatorpartikel (RP) bindet und gleichzeitig Ubiquitinerkennung, Deubiquitinierung und Substrattranslokation blockiert. Dieser Tripel-Blockade- Mechanismus unterdrückt die Proteasomaktivität und liefert ein Modell für die Kontrolle des Proteinabbaus. Die evolutionäre Konservierung von PITHD1 spricht für eine breitere Rolle in der Proteasomregulation bei Vertebraten. Beide Teile dieser Arbeit konvergieren auf gemeinsame Oberflächen im 19S RP. Der K11 Zweig K11/K48 verzweigter Ubiquitinketten bindet an die RPN2 RPN10 Spalte, während das proximale Ubiquitin das aktive Zentrum der Deubiquitinase RPN11 besetzt. Beide Regionen werden auch von PITHD1 adressiert und heben damit eine gemeinsame Bindungsstelle für topologiespezifische Erkennung und Inhibition hervor. Insgesamt liefern diese Arbeiten einen strukturellen Rahmen dafür, wie die Topologie von Ubiquitinketten die Interaktion mit dem Proteasom prägt und wie PITHD1 die Aktivität des 26S Proteasoms zur Regulation der Proteostase unterdrückt.
Abstract
(Englisch)
Targeted protein degradation by the ubiquitin proteasome system (UPS) is essential for eukaryotic life and underlies processes ranging from cell cycle control to cellular quiescence. At the centre of this system is the 26S proteasome, which recognizes ubiquitinated proteins and catalyses their unfolding and degradation. However, the structural basis of proteasome regulation, including substrate selection and inhibition, has remained incompletely understood. In this thesis, I investigate how the human 26S proteasome is regulated by distinct ubiquitin chain architectures and by an endogenous inhibitor. In the first part of this work, I used kinetic assays to analyse how the 26S proteasome processes substrates carrying different ubiquitin chain types. K48 linked chains promoted efficient degradation, whereas K11/K48 branched chains enhanced degradation even further. Using cryoEM, I determined how the proteasome interacts with canonical K48 linked ubiquitin chains and with K11/K48 branched chains. These structures revealed that K48 linked chains adopt an unexpected spiral conformation around ubiquitin interacting motif 1 (UIM1) of the receptor RPN10, whereas K11 branches engage a cleft formed between RPN10 and RPN2. Structure guided mutagenesis and cellular assays showed that these topology specific interactions are required for efficient protein degradation and cell growth. In the second part, I identified PITHD1 as a factor enriched on 26S proteasomes in dormant zebrafish eggs. Using cryoEM, I showed that PITHD1 binds the 19S regulatory particle (RP) and simultaneously blocks ubiquitin recognition, deubiquitination, and proteasome activation. This triple-lock-mechanism suppresses proteasomal activity and provides a model for the control of protein degradation. The evolutionary conservation of PITHD1 suggests a broader role in proteasome regulation across vertebrates. Both parts of this thesis converge on shared surfaces in the 19S RP. The K11 branch of K11/K48 branched ubiquitin engages the cleft between RPN2 and RPN10, while the proximal ubiquitin engages the active site of the deubiquitinase RPN11. Both regions are also targeted by PITHD1, highlighting a common interface for topology specific recognition and inhibition. Together, these studies provide a structural framework for how ubiquitin chain topology shapes proteasome engagement and how PITHD1 suppresses 26S proteasome activity to regulate proteostasis.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
26S Proteasom Ubiquitin Strukturbiologie Kryoelektronenmikroskopie Biochemie
Schlagwörter
(Englisch)
26S proteasome Ubiquitin Structural biology Cryogenic electron microscopy Biochemistry
Autor*innen
Sascha Josef Amann 
Haupttitel (Englisch)
Means and modes of 26S proteasomal substrate degradation
Hauptuntertitel (Englisch)
regulation by ubiquitin chains and the endogenous factor PITHD1
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
123 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Sascha Martens ,
Brenda A. Schulman
Klassifikationen
35 Chemie > 35.70 Biochemie. Allgemeines ,
42 Biologie > 42.12 Biophysik
AC Nummer
AC18046828
Utheses ID
80913
Studienkennzahl
UA | 794 | 620 | 490 |