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Wadjet in a eukaryotic system
Aron Christian Bernhard
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Biologische Chemie
Betreuer*in
Franz Klein
DOI
10.25365/thesis.81473
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-21736.48539.541618-9
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Entdeckung von CRISPR hat den immensen Wert von Forschung an bakteriellen Immunsystemen gezeigt. Seither wurden viele neue und diverse Verteidigungssysteme im Pan-Genom der Bakterien gefunden. Besonders einzigartig und vielversprechend unter diesen ist das Anti-Plasmid system WADJET. Es besteht aus vier Proteinen, von denen drei einen SMC-Komplex bilden, der die Topologie der DNA erkennt, wahrscheinlich über Loop Extrusion. Das übrige vierte Protein ist eine Nuklease, welche die DNA schneidet. Zusammen können diese Proteine selektiv zirkuläre DNA, bis zu einem gewissen Größenlimit, identifizieren und schneiden. Ziel dieser Arbeit war es WADJET zum ersten Mal in einem Eukaryoten, der Hefe S. cerevisiae, zu erforschen. Wir haben gefunden, dass die Kleisin Komponente, JetA, nicht detektierbar war in ihrer nativen Form, jedoch konnten wir stabile Expression erreichen durch die Fusion des fluoreszenten Tags Venus an den C-Terminus des Proteins. Die Expression der WADJET Proteine war nicht toxisch für die Hefe und sie wurden in großer Zahl im Zellkern gefunden. Wir haben zwei Tests etabliert, um potenzielle Plasmid Restriction durch WADJET nachzuweisen, ein ADE2 Farbsektor-Screen und ein Assay für den direkten Nachweis von Anreicherung linearen Plasmids. Zudem haben wir versucht es an Chromatin-freien Plasmiden zu testen mit Transformation Effizienz als Näherung. Ohne weitere Modifikationen kann WADJET Plasmide in Hefe nicht destabilisieren oder linearisieren. Der Transformations-Assay hat sich als uninformativ herausgestellt, da unerwarteter Weise, unser System für die Induktion mit Estrogen und Gal4.ER Plasmidstabilität, Transformationeffizienz und Zellwachstum beeinflusst.
Abstract
(Englisch)
The discovery of CRISPR has shown how valuable research into bacterial immune systems can be. Since then, many new and diverse defense systems have been unearthed in the bacterial pan-genome. Particularly unique and promising among these is the plasmid defense system WADJET. It consists of four proteins, three of which form an SMC complex sensing the topology of the DNA substrate, likely by loop extrusion. The remaining fourth component is a nuclease responsible for cleavage. Together they selectively recognize and cleave circular DNA up to a certain size limit. In this thesis we aimed to test WADJET for the first time in a eukaryote, the budding yeast S. cerevisiae. We found that the Kleisin component JetA was undetectable in its native form but succeeded in its stable expression after fusing the fluorescent protein tag Venus to its C-terminus. Expressing some or all components of the WADJET complex did not adversely affect growth of yeast. Proteins were abundantly detected in yeast nuclei. We established 2 independent assays for detecting potential plasmid loss as a result of WADJET activity, an ADE2 based color sectoring assay and a physical assay for linearization based on plasmid enrichment. We also tried to test it on chromatin free plasmids using transformation efficiency as a proxy. However, without further modifications, expression of the WADJET complex did not alter plasmid stability and did not cause any linearization. Our assay for transformation with naked DNA proved non informative, because, unexpectedly, our induction system using estrogen and the transcription activator Gal4.ER strongly affected plasmid stability, transformation efficiency and cell growth.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
WADJET Plasmid Bakterielle Immunität Heterologe Expression Hefe SMC Loop extrusion
Schlagwörter
(Englisch)
WADJET Plasmid Bacterial Immunity Heterologous expression SMC Loop extrusion
Autor*innen
Aron Christian Bernhard
Haupttitel (Englisch)
Wadjet in a eukaryotic system
Paralleltitel (Deutsch)
Wadjet in einem Eukaryot
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
93 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Franz Klein
Klassifikationen
35 Chemie > 35.70 Biochemie. Allgemeines ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC17918559
Utheses ID
81243
Studienkennzahl
UA | 066 | 863 | |