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The role of the enzymatic function of histone deacetylase 1 (HDAC1) in cutaneous lipid metabolism
Paula-Izabela Paşca
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molecular Biology
Betreuer*in
Heinz Fischer
DOI
10.25365/thesis.81536
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-10539.61689.919936-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Lipogenese in den Talgdrüsen wird durch das Zusammenspiel hormoneller, metabolischer und epigenetischer Mechanismen reguliert, wobei das Gleichgewicht zwischen Histonacetylierung und -deacetylierung an den Promotoren lipogener Gene als entscheidender Regulationsmechanismus fungiert. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Hemmung von Histon-Deacetylasen (HDAC) der Klasse I in menschlichen SZ95-Sebozyten eine Lipidakkumulation und eine transkriptionelle Hochregulation von Lipid-assoziierten Genen induziert. Der spezifische Beitrag der katalytischen Aktivität von HDAC1, im Unterschied zu seinen strukturellen und gerüstbildenden Funktionen innerhalb von Co-Repressor-Komplexen, blieb jedoch ungeklärt. Diese Studie untersuchte die Rolle der enzymatischen Aktivität von HDAC1 bei der epigenetischen Regulation des Lipidstoffwechsels in SZ95-Sebozyten anhand von drei sich ergänzenden Ansätzen: pharmakologische Intervention, gentechnische Manipulation und chromatinbasiertes Profiling. Die kombinierte Behandlung von SZ95-Zellen mit Insulin, dem Leber-X-Rezeptor (LXR)-Agonisten TO901317 und dem Klasse-I-HDAC-Inhibitor MS-275 (Entinostat) führte zu einer starken Induktion der Lipidtröpfchenbildung, wie durch Oil-Red-O-Färbung (ORO) quantifiziert, und bewirkte eine Hochregulation der lipidassoziierten Proteine Sterol-Regulatory-Element-Binding-Protein 1 (SREBP-1), Stearoyl-CoA-Desaturase (SCD) sowie die Fettsäuresynthase (FAS) auf Proteinebene. Der p300/CBP-Histonacetyltransferase-Inhibitor A-485 konnte die durch MS-275 induzierte Lipidakkumulation teilweise aufheben und auf ein Niveau reduzieren, das mit der Behandlung mit Insulin + TO901317 allein vergleichbar war. Dies zeigt, dass die durch die HDAC-Inhibition verstärkte Lipogenese von der katalytischen Aktivität von p300 abhängig ist. Der siRNA-vermittelte Knockdown von HDAC1, HDAC2 und HDAC3 wurde auf Proteinebene mittels Western Blot validiert, wobei sich nach Depletion eines der beiden Paraloge eine wechselseitige kompensatorische Hochregulation zwischen HDAC1 und HDAC2 zeigte. Trotz des erfolgreichen Knockdowns ergab die ORO-Quantifizierung nur geringfügige Anstiege der Lipidakkumulation, und der kombinierte Knockdown von HDAC1 und HDAC2 bewirkte keinem additiven Effekt. Diese abgeschwächte Reaktion könnte eine putative Co-Repressor-Komplex-abhängige gegenseitige Stabilisierung von HDAC1 und HDAC2 widerspiegeln, wobei der Verlust eines Paralogs zu einer Erhöhung des jeweils anderen führt, möglicherweise infolge einer verstärkten Integration in Sin3-, NuRD- und CoREST-Komplexe, wodurch die Deacetylase-Aktivität teilweise erhalten bleibt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden stabile SZ95-Zelllinien generiert, die mittels CRISPR/Cas9 vermittelten Knock-in am AAVS1 Safe Harbour Locus FLAG-getaggtes Wildtyp-HDAC1 beziehungsweise die katalytisch inaktive HDAC1-H141A-Variante exprimieren. Insgesamt wurden 20 Klone und Subklone erzeugt, was unseres Wissens die erste Beschreibung von SZ95-Sebozyten-Zelllinien darstellt, die so konstruiert wurden, dass sie ein bestimmtes Gen stabil exprimieren. Die Integration und Expression des Transgens wurden mittels FLAG-Immunfluoreszenz, Nested-PCR sowie Sanger-Sequenzierung anhand der Mus musculus HDAC1-Referenzsequenz (NCBI: NM_008228.3) bestätigt. Deacetylase-Aktivitätstests an FLAG-immunpräzipitierten Proben zeigten, dass HDAC1WT-Klone eine robuste enzymatische Aktivität beibehielten, während HDAC1H141A-Klone eine deutlich reduzierte, aber verbleibende Aktivität aufwiesen, was mit der heterozygoten Natur des Systems und der Co-Immunpräzipitation von endogenem HDAC1 und HDAC2 erklärbar ist. Die Co-Immunpräzipitation von Sin3A, CoREST, MTA2 und Sap30 mit dem FLAG-H141A-Protein bestätigte, dass die katalytische Mutation die Assemblierung beziehungsweise strukturelle Integrität der Co-Repressor-Komplexe nicht beeinträchtigt. Entscheidend ist, dass die kompensatorische HDAC2-Hochregulation, die bei siRNA-vermitteltem HDAC1-Knockdown beobachtet wurde, nicht durch die Expression des katalytisch inaktiven Allels ausgelöst wurde, was zeigt, dass diese Kompensation durch den Verlust des HDAC1-Proteins und nicht durch den Verlust der katalytischen Aktivität bedingt ist. Die Immunfluoreszenzfärbung für H2BK5ac und H3K27ac zeigte keine globalen Unterschiede in der Histonacetylierung zwischen den H141A- und den Kontrollklonen, was mit einer teilweisen, jedoch nicht vollständigen Reduktion der HDAC1-Aktivität vereinbar ist. Die FAS-Proteinkonzentrationen stiegen nach Stimulation mit Insulin+TO901317 in den HDAC1H141A-Klonen an, wobei die Induktion im Vergleich zu FLAG-negativen Kontrollen verstärkt war. Dies deutet darauf hin, dass bereits eine teilweise Reduktion der katalytischen Aktivität von HDAC1 ausreicht, um die lipogene Transkriptionsreaktion zu verstärken. Zur Etablierung der Chromatinprofilierung mittels CUT&RUN wurde ein Antikörper gegen H3K4me3 verwendet, eine Histonemarkierung transkriptionell aktiven Promotoren. Dabei zeigte sich, dass es in SZ95-Sebozyten nach lipogener Stimulation es zu lokusspezifischen Veränderungen der Promotor-assoziierten Chromatinzustände kommt. Am SREBF1-Locus führte die Kombinationsbehandlung mit Insulin, TO901317 und MS-275 zu Ausbildung einer zweiten H3K4me3-angereicherte Region des konstitutiv aktiven kanonischen SREBP-1a-Promotors, was mit der Aktivierung des alternativen LXR-responsiven SREBP-1c-Promotors vereinbar ist. An den FASN- und SCD1-Loci war das H3K4me3-Signal über die bereits aktiven Ausgangswerte hinaus verstärkt, was auf eine weitere transkriptionelle Aktivierung hindeutet. Am ABCA1-Locus führte die Behandlung zur ausgeprägten de novo H3K4me3- Peaks ausgehend von einer nahezu nicht vorhandenen Ausgangsbasis, was das deutlichste Beispiel für eine behandlungsabhängige Promotoraktivierung darstellt. Drei Kontroll-loci (DLX2, ZNF713, EOLA2) zeigten unter der Behandlung eine verringerte H3K4me3-Belegung, was bestätigt, dass die beobachteten Chromatinveränderungen lokusspezifisch waren und nicht auf eine globale Chromatin-Umgestaltung zurückzuführen sind. Diese Ergebnisse stützen ein konvergentes epigenetisches Modell, wonach die katalytische Aktivität von HDAC1 normalerweise die Histonacetylierung an den Promotoren lipogener Gene in menschlichen Sebozyten hemmt. Eine Störung dieser Aktivität – sei es durch chemische Inhibition, siRNA-vermittelten Knockdown oder partielle katalytische Inaktivierung über das H141A-Allel – ermöglicht das Fortbestehen der p300-abhängige Acetylierung an diesen Loci und begünstigt dadurch die Ausbildung eines transkriptionell permissiver Chromatinzustand, der die Aktivierung des SREBP-1-gesteuerten lipogenen Programms unterstützt. Diese Studie positioniert HDAC1 als epigenetischen Gatekeeper der TalgdrüsenlLipogenese, dessen partielle Inaktivierung ausreicht, um das Gleichgewicht an wichtigen regulatorischen Loci zugunsten eines hyperacetylierten, pro-lipogenen Chromatinzustand zu verschieben. Dies weist auf eine potenzielle Relevanz für die Pathogenese sowie zukünftige therapeutische Strategien bei Talgdrüsenerkrankungen wie Akne vulgaris hin.
Abstract
(Englisch)
Sebaceous gland lipogenesis is regulated by the interplay of hormonal, metabolic, and epigenetic mechanisms, with the balance between histone acetylation and deacetylation at lipogenic gene promoters serving as a critical regulatory axis. Previous work in our lab demonstrated that class I histone deacetylase (HDAC) inhibition induces accumulation of neutral lipids and transcriptional upregulation of lipid-associated genes in human SZ95 sebocytes. However, the specific contribution of HDAC1 catalytic activity, as distinct from its structural and scaffolding functions within co-repressor complexes, remained unresolved. This study investigated the role of HDAC1 enzymatic activity in the epigenetic regulation of lipid metabolism in SZ95 sebocytes through three complementary approaches: pharmacological perturbation, genetic engineering, and chromatin-level profiling. Combined treatment of SZ95 cells with insulin, the liver X receptor (LXR) agonist TO901317, and the class I HDAC inhibitor MS-275 (entinostat) produced the strongest induction of lipid droplet formation, as quantified by Oil Red O (ORO) staining, and upregulated the lipid-associated proteins sterol regulatory element-binding protein 1 (SREBP-1), stearoyl-CoA desaturase (SCD), and fatty acid synthase (FAS) at the protein level. The p300/CBP histone acetyltransferase inhibitor A-485 partially rescued the MS-275-induced lipid accumulation, reducing it to levels comparable to insulin+TO901317 treatment alone, thereby demonstrating that the enhanced lipogenesis driven by HDAC inhibition is dependent on p300 catalytic activity. siRNA-mediated knockdown of HDAC1, HDAC2, and HDAC3 was validated at the protein level by Western blotting, revealing a reciprocal compensatory upregulation between HDAC1 and HDAC2 upon depletion of either paralog. Despite successful knockdown, ORO quantification showed only minor increases in lipid accumulation, and combined HDAC1+HDAC2 knockdown did not produce an additive effect. This blunted response could reflect a putative co-repressor complex-dependent mutual stabilization of HDAC1 and HDAC2, whereby loss of one paralog elevates the other, potentially through increased incorporation into Sin3, NuRD, and CoREST scaffolds, partially sustaining deacetylase activity. To overcome these limitations, stable SZ95 cell lines expressing FLAG-tagged wild-type HDAC1 or the catalytically inactive HDAC1 H141A variant were generated via CRISPR/Cas9-mediated knock-in at the AAVS1 safe-harbor locus. In total, 20 clones and subclones were produced, representing, to our knowledge, the first report of SZ95 sebocyte cell lines engineered to stably express a gene of interest. Transgene integration and expression were confirmed by FLAG immunofluorescence, nested PCR, and Sanger sequencing against the Mus musculus HDAC1 reference sequence (NCBI: NM_008228.3). Deacetylase activity assays on FLAG-immunoprecipitated samples demonstrated that WT clones retained robust enzymatic activity, while H141A clones displayed significant reduced but residual activity, consistent with the heterozygous nature of the system and co-immunoprecipitation of endogenous HDAC1 and HDAC2. Co-immunoprecipitation of Sin3A, CoREST, MTA2, and Sap30 with FLAG-HDAC1 H141A protein confirmed that the catalytic mutation preserves co-repressor complex assembly. Importantly, the compensatory HDAC2 upregulation observed upon siRNA-mediated HDAC1 knockdown was not triggered by expression of the catalytically inactive allele, demonstrating that this compensation is driven by loss of HDAC1 protein rather than loss of catalytic activity. Immunofluorescence staining for H2BK5ac and H3K27ac showed no global changes in histone acetylation between H141A and control clones, consistent with partial rather than complete reduction of HDAC1 activity. FAS protein levels increased upon insulin+TO901317 stimulation in H141A clones, with enhanced induction compared to FLAG-negative controls, indicating that partial reduction of HDAC1 catalytic activity is sufficient to amplify the lipogenic transcriptional response. CUT&RUN chromatin profiling using an antibody against H3K4me3, a histone mark associated with transcriptionally active promoters, was established in SZ95 sebocytes and revealed locus-specific changes in promoter-associated chromatin states under lipogenic stimulation. At the SREBF1 locus, combination treatment induced a second H3K4me3-enriched region downstream of the constitutively active canonical SREBP-1a promoter, consistent with activation of the alternative LXR-responsive SREBP-1c promoter. At the FASN and SCD loci, H3K4me3 signal was enhanced above already active baselines, indicating further transcriptional activation. At the ABCA1 locus, a sharp de novo H3K4me3 peak was induced from a near-absent baseline, representing the clearest example of treatment-dependent promoter activation. Three control loci (DLX2, ZNF713, EOLA2) displayed reduced H3K4me3 occupancy under treatment, confirming that the observed chromatin changes were locus-specific and not attributable to global chromatin remodeling. These findings support a convergent epigenetic model in which HDAC1 catalytic activity normally restrains histone acetylation at lipogenic gene promoters in human sebocytes. Perturbation of this activity, whether through chemical inhibition, siRNA-mediated knockdown, or partial catalytic inactivation via the H141A allele, permits p300-dependent acetylation to persist at these loci, establishing a transcriptionally permissive chromatin state that supports activation of the SREBP-1 driven lipogenic program. This study positions HDAC1 as an epigenetic gatekeeper of sebaceous lipogenesis whose partial inactivation is sufficient to shift the balance toward a hyperacetylated, pro-lipogenic chromatin state at key regulatory loci, with potential relevance for the pathogenesis and future therapeutic targeting of sebaceous gland disorders such as acne vulgaris.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Histon-Deacetylasen (HDAC) SZ95-Sebozyten epigenetischer Lipogenese
Autor*innen
Paula-Izabela Paşca
Haupttitel (Englisch)
The role of the enzymatic function of histone deacetylase 1 (HDAC1) in cutaneous lipid metabolism
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
V, 98 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Heinz Fischer
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC17929105
Utheses ID
81395
Studienkennzahl
UA | 066 | 865 | |