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Synthesis of phosphorylated isoforms of the Survival Motor Neuron (SMN) protein
Michael Palka
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Chemie
Betreuer*in
Christian Friedrich Wilhelm Becker
DOI
10.25365/thesis.81586
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-17523.65524.467920-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die spinale Muskelatrophie (SMA) wird durch funktionsbeeinträchtigende Mutationen des SMN-Proteins ausgelöst. Zum besseren Verständnis der Entstehung von SMA müssen sowohl die Funktionsweise als auch die unterschiedlichen Regulierungswege des SMN-Proteins untersucht werden. Posttranslationale Modifikationen (PTMs), insbesondere Phosphorylierungen, spielen hierbei eine entscheidende Rolle. Um deren Auswirkungen zu untersuchen, werden homogene, modifizierte SMN-Proteinvarianten in ausreichenden Mengen benötigt. Diese Arbeit konzentriert sich daher auf die Entwicklung einer vollständig synthetischen Strategie zur Synthese der N-terminalen Domäne des SMN-Proteins (Aminosäuren 1–160) und die anschließende Herstellung von SMN(1–160)-Varianten mit unterschiedlichen Phosphorylierungsmustern. Um einen vollsynthetischen Ansatz zu ermöglichen, wurde die Zielsequenz zunächst in vier Segmente unterteilt, um die Größenbeschränkung der Festphasenpeptidsynthese (SPPS) zu überwinden. Das Segmentdesign basierte auf der Position nativer Cysteine innerhalb der SMN-Aminosäuresequenz sowie auf der Länge und den Löslichkeitseigenschaften der resultierenden Segmente, wodurch eine effiziente Verknüpfung mittels nativer chemischer Ligation (NCL) gewährleistet wurde. Alle Peptidsegmente wurden zunächst mittels SPPS hergestellt, inklusive phosphorylierter Varianten der zwei N-terminalen Segmente, um die Erzeugung unterschiedlich modifizierter SMN-Varianten zu ermöglichen. Die einzelnen Peptide wurden anschließend durch konvergierende Ligationen zusammengefügt. Zunächst wurden die Peptide 1–59 und 60–97 sowie 98–122 und 123–160 ligiert. Die anschließende Ligation der beiden resultierenden Segmente 1–97 und 98–160 ergab SMN(1–160). Die phosphorylierten Varianten wurden durch unterschiedliche Kombination der modifizierten und unmodifizierten Peptide 1–59 und 60–97 synthetisiert. Insgesamt wurden eine nicht phosphorylierte, zwei monophosphorylierte sowie eine diphosphorylierte Variante von SMN(1–160) erfolgreich hergestellt. Nach der erfolgreichen Synthese wurden alle Varianten mittels HPLC und HR-MS charakterisiert. Um die Auswirkungen der Phosphorylierungen auf die sekundären Strukturelemente sowie die Faltung des Proteins zu untersuchen, wurde Zirkulardichroismus-Spektroskopie (CD) durchgeführt. Die Messungen ergaben nur geringfügige Unterschiede zwischen den Varianten und zeigten eine insgesamt geringe Ausprägung sekundärer Strukturelemente, was auf suboptimale Faltungsbedingungen hindeutet. Insgesamt stellt die hier vorgestellte Synthesestrategie einen Ausgangspunkt für die Erzeugung weiterer SMN-Proteinvarianten dar und bildet die Grundlage für zukünftige Studien zu SMA und den ihr zugrunde liegenden molekularen Mechanismen.
Abstract
(Englisch)
Spinal muscular atrophy (SMA) is caused by function-impairing mutations in the SMN protein. To gain a better understanding of the molecular mechanisms underlying SMA, both the function and the regulatory pathways of the SMN protein require further investigation. Posttranslational modifications (PTMs), particularly phosphorylation, play a crucial role in this context. To study their effects, homogeneous, modified SMN protein variants are needed in sufficient quantities. This work therefore focuses on the development of a fully synthetic strategy for the synthesis of the N-terminal domain of the SMN protein (amino acids 1–160) and the subsequent production of SMN(1–160) variants with distinct phosphorylation patterns. To enable a fully synthetic approach, the target sequence was divided into four segments to overcome the size limitations of solid phase peptide synthesis (SPPS). The segment design was based on the positions of native cysteines within the SMN sequence, as well as on the length and solubility of the resulting segments, ensuring efficient assembly via native chemical ligation (NCL). All peptide segments were first synthesized using SPPS, including two phosphorylated variants of the two N-terminal segments, to allow for the generation of differentially modified SMN variants. The individual peptides were assembled through convergent ligation steps. Initially, peptides 1–59 and 60–97, as well as segments 98–122 and 123–160, were ligated. Subsequent ligation of the two resulting segments 1–97 and 98–160 yielded SMN(1–160). The phosphorylated variants were obtained by assembling the modified peptides 1–59 and 60–97 in different configurations. In total, one non-phosphorylated, two monophosphorylated, and one diphosphorylated variant of SMN(1–160) were successfully produced. Following successful synthesis, all variants were characterized using HPLC and HR-MS. The influence of phosphorylation on secondary structure and protein folding was subsequently assessed by circular dichroism (CD) spectroscopy. The measurements revealed only minor differences among the variants and indicated a low overall content of secondary structural elements, suggesting suboptimal folding conditions. Overall, the herein presented synthetic strategy provides a basis for the generation of additional SMN protein variants and for future studies on SMA and its underlying molecular mechanisms.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
SMN Posttranslationale Modifikationen Spinale Muskelatrophie Totalsynthese Native Chemische Ligation Surival Motor Neuron Protein
Schlagwörter
(Englisch)
SMN Posttranslational modifications Spinal muscular atrophy Total chemical synthesis Native chemical ligation Survival Motor Neuron protein
Autor*innen
Michael Palka
Haupttitel (Englisch)
Synthesis of phosphorylated isoforms of the Survival Motor Neuron (SMN) protein
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
69 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Christian Friedrich Wilhelm Becker
Klassifikation
35 Chemie > 35.76 Aminosäuren. Peptide. Eiweiße
AC Nummer
AC17946174
Utheses ID
81515
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |