Detailansicht
Integrative CUT&RUN and single-cell multiome analysis reveals putative neural crest enhancers and promoters associated with orofacial cleft risk loci
Inês Vitória Naidenka Rosa
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Neuroscience
Betreuer*in
Igor Adameyko
DOI
10.25365/thesis.81622
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-19215.71298.244817-0
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Orofaziale Spalten (OFCs)gehören zu den häufigsten angeborenen kraniofazialen Fehlbildungen und entstehen durch ein komplexes Zusammenspiel genetischer und umweltbedingter Faktoren. Obwohl genomweite Assoziationsstudien (Genome-Wide Association Studies, GWAS) zahlreiche mit dem OFC-Risiko assoziierte Genloci identifiziert haben, sind die regulatorischen Mechanismen, über die diese Varianten die kraniofaziale Entwicklung beeinflussen, bislang nur unzureichend verstanden. Da sich die meisten assoziierten Varianten in nicht-kodierenden Bereichen des Genoms befinden, ist die Identifizierung der regulatorischen Elemente und Zielgene, über die sie ihre Wirkung entfalten, eine besondere Herausforderung. Ziel dieser Studie war es, potenzielle regulatorische Elemente zu identifizieren und zu priorisieren, die mit OFC-Risikoloci in kranialen Neuralleistenzellen (cranial neural crest cells, CNCCs) assoziiert sind, sowie einen Ansatz zur Verknüpfung nicht-kodierender genetischer Varianten mit genregulatorischen Netzwerken der kraniofazialen Entwicklung zu etablieren. Mit OFCs assoziierte genetische Varianten wurden aus zwei publizierten GWAS-Datensätzen gewonnen und ihre humanen genomischen Koordinaten in entsprechende Mauskoordinaten überführt. Die Annotation neuralleistenspezifischer Muster der Chromatinzugänglichkeit sowie von Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in diesen OFC-assoziierten Regionen erfolgte anhand von Single-Cell-ATAC- Sequenzierungsdaten (scATAC-seq) von Neuralleistenzellen sowie CUT&RUN-Profilen für vier Neuralleisten-Transkriptionsfaktoren und verschiedene Histonmodifikationsmarker. Regionen, die Transkriptionsfaktorbindung, charakteristische Histonsignaturen und Chromatinzugänglichkeit aufwiesen, wurden als relevante Kandidatenloci ausgewählt. Überlappende Neuralleisten-scATAC-seq-Peaks dienten anschließend zur Definition der Grenzen potenzieller regulatorischer Elemente. Diese wurden anhand ihrer Transkriptionsfaktor-Bindungsmuster und Histonmodifikationen charakterisiert und mithilfe von BEDTools closest ihren nächstgelegenen Genen zugeordnet. Die Expression der Zielgene wurde anhand von Single-Cell-RNA-Sequenzierungsdaten (scRNA-seq) aus E9.5-Neuralleistenzellen untersucht. Zusätzlich wurde eine de novo Motivanalyse durchgeführt, um weitere Transkriptionsfaktor-Bindungsmotive innerhalb der Kandidatenregionen zu identifizieren. Die integrative Analyse identifizierte 38 genomische Regionen, die sowohl mit einem erhöhten OFC-Risiko als auch mit regulatorischer Aktivität in Neuralleistenzellen assoziiert waren, und ermöglichte deren Verknüpfung mit potenziellen Zielgenen. Vier Kandidatenregionen wurden auf Grundlage ihrer Chromatinsignaturen und Expressionsmuster für eine detaillierte Charakterisierung ausgewählt. Drei Regionen, die mit den Genen Mafb, Itgb1 und Rtn3 assoziiert waren, überlappten annotierte Promotorregionen und zeigten eine Anreicherung von H3K4me3 sowie die Bindung mehrerer Neuralleisten-Transkriptionsfaktoren, was auf eine promotorassoziierte regulatorische Aktivität hinweist. Im Gegensatz dazu befand sich die mitPard3assoziierte Region innerhalb eines intronischen Bereichs und wies eine H3K4me1-Anreicherung ohne nachweisbare Transkriptionsfaktorbindung auf, was mit den Eigenschaften eines potenziellen Enhancers übereinstimmt. Die de novo Motivanalyse identifizierte 46 signifikant angereicherte Motive, darunter Bindungsstellen für LEF1, MSX1, RARG und SMAD4 – Transkriptionsfaktoren, die nachweislich an der Spezifikation der Neuralleiste, der Gaumenentwicklung und der kraniofazialen Morphogenese beteiligt sind. Von den 38 identifizierten Zielgenen wurden bislang lediglich sieben mit OFCs in Verbindung gebracht, was die begrenzte funktionelle Charakterisierung vieler GWAS-assoziierter Loci verdeutlicht. Darüber hinaus wurde keines der in dieser Studie identifizierten potenziellen cis-regulatorischen Elemente bisher im Zusammenhang mit OFC-assoziierten GWAS-Loci beschrieben. Zusammenfassend liefert diese Arbeit einen priorisierten Katalog potenzieller neuralleistenspezifischer regulatorischer Elemente, die mit OFC-Risikoloci assoziiert sind, und etabliert einen reproduzierbaren Ansatz zur Verknüpfung nicht-kodierender genetischer Varianten mit genregulatorischen Mechanismen, die der kraniofazialen Entwicklung und der Anfälligkeit für orofaziale Spalten zugrunde liegen.
Abstract
(Englisch)
Orofacial clefts (OFCs) are among the most common congenital craniofacial malformations and arise through complex interactions between genetic and environmental factors. Although genome-wide association studies (GWAS) have identified numerous loci associated with OFC risk, the regulatory mechanisms through which these variants influence craniofacial development remain poorly understood. Most associated variants are located within non-coding regions of the genome, making it challenging to identify the regulatory elements and target genes through which they act. This study aimed to identify and prioritize putative regulatory elements associated with OFC risk loci in cranial neural crest cells (CNCCs) and to establish a framework for linking non-coding genetic variation to gene regulatory networks involved in craniofacial development. Genetic variants associated with OFCs were obtained from two published Genome Wide Association Studies (GWAS) datasets and human genomic coordinates were converted to the mouse genomic coordinates. The presence of neural crest-specific chromatin openness patterns and transcription factor binding in these OFC-associated regions were annotated by using neural crest cell scATAC-sequencing (scATAC-seq) data and CUT&RUN profiles for four neural crest transcription factors and histone modifications markers. Regions exhibiting transcription factor occupancy, histone signatures and chromatin accessibility were retained as loci of interest . Neural crest scATAC-seq peaks overlapping these loci were subsequently used to define the boundaries of putative regulatory elements, which were then characterized using transcription factor binding and histone modification profiles and linked to their nearest genes using BEDTools closest. The resulting regulatory elements were assigned to their nearest genes. Gene expression of the target genes was assessed using E9.5 neural crest single cell RNA sequencing (scRNA-seq) data. De novo motif enrichment analysis was performed to identify additional transcription factor binding signatures within the candidate regulatory regions. This integrative analysis identified 38 genomic regions associated with both, increased OFC risk and regulatory activity in neural crest cells and allowed linking them to putative target genes. Four candidate regions were selected for detailed characterization based on chromatin signatures and gene expression patterns. Three regions associated with Mafb, Itgb1, and Rtn3 overlapped annotated promoter regions and displayed H3K4me3 enrichment together with occupancy by multiple neural crest transcription factors, consistent with promoter associated regulatory activity. In contrast, the region associated with Pard3 was located within an intronic interval and exhibited H3K4me1 enrichment without detectable transcription factor occupancy, consistent with a putative enhancer region. De novo motif analysis identified 46 significantly enriched motifs, including binding sites for LEF1, MSX1, RARG, and SMAD4, transcription factors with established roles in neural crest specification, palatogenesis, and craniofacial morphogenesis. Of the 38 associated genes, only seven have previously been linked to OFCs, highlighting the limited functional characterization of many GWAS-associated loci. Moreover, none of the candidate cis-regulatory elements identified in this study have previously been described in the context of OFC-associated GWAS loci. Together, these findings provide a prioritized catalogue of candidate neural crest regulatory elements associated with OFC risk loci and establish a reproducible framework for connecting non- coding genetic variation to gene regulatory mechanisms underlying craniofacial development and susceptibility to orofacial clefts.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Orofaziale Spalten Kraniale Neuralleistenzellen Cis-regulatorische Elemente Enhancer Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) Epigenomik Einzelzell-Multiomik Craniofaziale Entwicklung
Autor*innen
Inês Vitória Naidenka Rosa
Haupttitel (Englisch)
Integrative CUT&RUN and single-cell multiome analysis reveals putative neural crest enhancers and promoters associated with orofacial cleft risk loci
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
56 Seiten, 14 ungezählte Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Igor Adameyko
AC Nummer
AC17956092
Utheses ID
81566
Studienkennzahl
UA | 066 | 232 | |