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Advanced blood group typing
a long-read sequencing approach for comprehensive blood group identification
Gergö Marton-Szücs
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molecular Microbiology, Microbial Ecology and Immunobiology
Betreuer*in
Angela Witte
DOI
10.25365/thesis.82022
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-12589.97333.407434-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Bestimmung von Blutgruppen ist für eine sichere Transfusionsmedizin, für Transplantationen sowie zur Vermeidung von Alloimmunisierungen von zentraler Bedeutung. Obwohl serologische Methoden weiterhin den diagnostischen Standard darstellen, können sie bei seltenen Varianten, Hybridallelen, kürzlich transfundierten Patient:innen oder bei Blutgruppenloci mit hoher Sequenzähnlichkeit zwischen verwandten Genen an ihre Grenzen stoßen. Molekulargenetische Verfahren können einige dieser Einschränkungen überwinden. Konventionelle zielgerichtete Analysen und Short-Read-Sequenzierungen ermöglichen jedoch häufig keine vollständige Charakterisierung strukturell komplexer Loci und keine eindeutige Zuordnung gemeinsam auftretender Varianten zu demselben Allel. Long-Read-Sequenzierung erhält die Verknüpfung von Varianten über größere genomische Bereiche und ermöglicht dadurch Haplotypisierung sowie den Nachweis neuer Varianten, Hybridallele und struktureller Veränderungen. Ziel dieser Masterarbeit war die Etablierung und Optimierung eines auf Long-Range-PCR basierenden Anreicherungsverfahrens für klinisch relevante Blutgruppenloci. Untersucht wurden ABO, KEL, MNS-assoziierte Regionen sowie RHD/RHCE-assoziierte Regionen. Der entwickelte Workflow sollte mit einer nachfolgenden Oxford-Nanopore-Sequenzierung kompatibel sein. Mehrere kommerziell verfügbare DNA-Polymerasen und PCR-Mastermixe wurden hinsichtlich ihrer Eignung zur Amplifikation großer genomischer Fragmente verglichen. Die Takara PrimeSTAR® GXL Fast DNA Polymerase zeigte die beste Kombination aus zuverlässiger Amplifikation, Spezifität, Reproduzierbarkeit und PCR-Laufzeit und wurde daher für die weitere Methodenentwicklung ausgewählt. Long-Range-Primerpaare wurden neu entworfen oder aus publizierten Ansätzen adaptiert und experimentell getestet. Die Agarosegelelektrophorese zeigte für ABO, KEL sowie die MNS- und RHD/RHCE-assoziierten Regionen deutliche hochmolekulare PCR-Produkte an den erwarteten ungefähren Positionen. Für ABO wurden drei überlappende Amplicons erzeugt, während für die ausgewählten KEL-Regionen zwei Amplicons erhalten wurden. Ausgewählte ABO- und KEL-Produkte wurden anschließend mittels Oxford-Nanopore-Sequenzierung analysiert. Die Sequenzierung bestätigte, dass die untersuchten Produkte aus den vorgesehenen genomischen Regionen stammten. Dies unterstützte die Spezifität der entsprechenden Primerpaare sowie die Eignung des optimierten PCR-Workflows für die nachfolgende Long-Read-Sequenzierung. Die MNS- und RHD/RHCE-assoziierten PCR-Produkte wurden aus Zeit- und Kostengründen nicht sequenziert und daher ausschließlich anhand ihrer Bandenpositionen im Agarosegel beurteilt. Da die Agarosegelelektrophorese keine eindeutige Bestimmung der genomischen Herkunft erlaubt, können diese Produkte noch nicht als validierte, zielregionsspezifische Amplicons eingestuft werden. Eine sequenzbasierte Bestätigung ist erforderlich, um Off-Target-Amplifikationen aus homologen genomischen Regionen auszuschließen. Insgesamt schafft diese Arbeit eine Grundlage für die gezielte Long-Read-basierte Analyse von Blutgruppengenen und zeigt die grundsätzliche Eignung einer Kombination aus optimierter Long-Range-PCR und Oxford-Nanopore-Sequenzierung für ausgewählte ABO- und KEL-Loci. Der etablierte Workflow bildet zudem die Grundlage für die zukünftige Validierung der MNS- und RHD/RHCE-assoziierten Produkte sowie für eine haplotypaufgelöste Charakterisierung von Blutgruppenallelen.
Abstract
(Englisch)
Blood group typing is essential for safe transfusion medicine, transplantation, and the prevention of alloimmunization. Although serological methods remain the routine standard, they can be limited in cases involving rare variants, hybrid alleles, recently transfused patients, or loci with high sequence similarity between related genes. Molecular genotyping can overcome several of these limitations, but conventional targeted assays and short-read sequencing may not fully resolve structurally complex loci or determine which variants occur on the same allele. Long-read sequencing preserves linkage between variants across extended genomic regions, enabling haplotype phasing and the detection of novel variants, hybrid alleles, and structural rearrangements. This thesis aimed to establish and optimize a long-range PCR-based enrichment workflow for clinically relevant blood group loci, including ABO, KEL, MNS-associated regions, and RHD/RHCE-associated regions, compatible with downstream Oxford Nanopore sequencing. Several commercially available DNA polymerases and PCR master mixes were compared for large-fragment amplification. Takara PrimeSTAR® GXL Fast DNA Polymerase provided the best balance of amplification reliability, specificity, reproducibility, and PCR runtime and was therefore selected for further workflow development. Long-range primer pairs were designed de novo or adapted from published approaches and experimentally tested for the selected loci. Agarose gel electrophoresis showed distinct high-molecular-weight products at the expected approximate positions for ABO, KEL, MNS-associated, and RHD/RHCE-associated regions. Three overlapping ABO amplicons and two amplicons covering the selected KEL regions were generated. Selected ABO and KEL products were subsequently analyzed by Oxford Nanopore sequencing. Sequencing confirmed their origin from the intended genomic regions, supporting primer specificity and the suitability of the optimized PCR workflow for downstream long-read sequencing. MNS and RHD/RHCE-associated PCR products were not sequenced because of time and cost constraints and were therefore evaluated only as gel bands with approximate sizes consistent with the expected products. As agarose gel electrophoresis cannot establish genomic identity, these products cannot yet be considered validated target-specific amplicons and require sequencing-based confirmation to exclude off-target amplification from homologous regions. Overall, this study establishes a foundation for targeted long-read blood group analysis and demonstrates the feasibility of combining optimized long-range PCR with Oxford Nanopore sequencing for selected ABO and KEL loci. The workflow provides a basis for future validation of MNS and RHD/RHCE-associated products and subsequent haplotype-resolved characterization of blood group alleles.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Blutgruppenbestimmung Blutgruppengenotypisierung Long-Read-Sequenzierung Oxford-Nanopore-Sequenzierung Long-Range-PCR Blutgruppengenetik Transfusionsmedizin
Schlagwörter
(Englisch)
Blood group typing Blood group genotyping Long-read sequencing Oxford Nanopore sequencing Long-range PCR Blood group genetics Transfusion medicine
Autor*innen
Gergö Marton-Szücs
Haupttitel (Englisch)
Advanced blood group typing
Hauptuntertitel (Englisch)
a long-read sequencing approach for comprehensive blood group identification
Paralleltitel (Deutsch)
Fortgeschrittene Blutgruppenbestimmung
Paralleluntertitel (Deutsch)
ein Long-Read-Sequenzierungsansatz zur umfassenden Charakterisierung von Blutgruppen
Publikationsjahr
2026
Umfangsangabe
50 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Angela Witte
Klassifikation
42 Biologie > 42.20 Genetik
AC Nummer
AC18040370
Utheses ID
82400
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |