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Engineering of a Benzodiazepine binding site into GABAA receptors composed of alpha1 and beta3 subunits
Anna Lidia Dereky
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Werner Sieghart
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.9350
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30028.75163.624954-6
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
GABAA Rezeptoren sind die wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter Rezeptoren des Säugetier Gehirns, und werden durch GABA (γ-Aminobuttersäure) aktiviert. Zahlreiche klinisch relevante Wirkstoffe wie Benzodiazepine, Barbiturate, Anästhetika können neben GABA an den GABAA Rezeptor binden und seine Wirkung modulieren. Obwohl diese Wirkstoffe in der Medizin eine breite Anwendung finden, ist die genaue Struktur der Bindungsstelle nicht bekannt. Dies macht ihn zu einem hoch interessanten Untersuchungsgegenstand der Neurobiologie. GABAA Rezeptoren bestehen aus fünf Untereinheiten. Die Mehrheit der Rezeptoren sind aus einer gamma (γ), zwei alpha (α), und zwei beta (β) Untereinheiten zusammengesetzt, wobei die hoch affine Bindung von Benzodiazepinen das Vorhandensein einer gamma Untereinheit voraussetzt. Jede Untereinheit hat per Definition eine plus und eine minus Seite. Die Benzodiazepin Bindungstelle befindet sich im extrazellulären Bereich zwischen der α-plus und der γ-minus Seite dieser Untereinheiten. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine hoch affine Benzodiazepin Bindungsstelle in einen α1β3 Rezeptor einzubauen, der im Gegensatz zu einem α1β3γ2 Rezeptor keine solche besitzt. Der α1β3 Rezeptor besteht aus zwei α und drei β Untereinheiten. Der Reihe nach wurden wichtige Aminosäuren der γ-minus Seite (eines α1β3γ2 Rezeptors) in die β-minus Seite des α1β3 Rezeptors eingebaut. Diese Aminosäuren wurden mittels eines in unserem Labor entwickelten strukturellen Modells der Diazepam-gebundenen Benzodiazepin Bindungsstelle und mittels bereits publizierter Artikel ausgewählt. Die Affinität von Benzodiazepinen wurde durch Radioliganden-Bindungsstudien an Membranen von HEK Zellen bestimmt die mit den entsprechenden Rezeptoren transfiziert worden waren. Die erhaltenen Resultate lassen darauf schließen, dass vier Mutationen (β3DGE) ausreichten, um eine hochaffine Benzodiazepin Bindungsstelle in die α1β3 Rezeptoren einzubauen. Die pharmakologische Charakterisierung wurde mittels einer zwei Elektroden Spannungsklemme in Xenopus laevis Oozyten vorgenommen. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die durch Flurazepam und Ro15-1788 ausgelöste Modulation der GABA Ströme der rekombinanten Rezeptoren α1β3DG (dreifach Mutante) und α1β3DGE von der des Wildtyp α1β3 Rezeptors unterscheidet.
Abstract
(Englisch)
GABAA receptors are the major inhibitory transmitter receptors in the brain and the site of action of many clinically important drugs, such as benzodiazepines, barbiturates, anesthetics and convulsants. The majority of GABAA receptors are composed of two alpha (α), two beta (β) and one gamma (γ) subunit. The two GABA binding sites are located at the two extracellular β-plus/α-minus interfaces whereas the binding site for benzodiazepines is located at the homologous α-plus/γ-minus interface. Despite the extensive clinical use of benzodiazepines, the molecular basis of their interaction with the GABAA receptor, as well as the protein structure of the benzodiazepine binding site is not known. To obtain information on the structural requirements of the benzodiazepine binding site, we investigated whether it is possible to engineer a benzodiazepine binding site into α1β3 receptors, which presumably are composed of two α1 and three β3 subunits and have no high affinity benzodiazepine binding site. To achieve this task, the β3-minus side had to be converted at least partially to a γ2-minus side. Using a structural model of the diazepam-bound benzodiazepine binding site as a template, that was recently developed by our group, as well as previously published mutagenesis data, we introduced several amino acid residues of the γ2-minus side that are important for benzodiazepine binding, into the β3-minus side of an α1β3 GABAA receptor. Benzodiazepine affinity was studied by radioligand binding assays with appropriately transfected human embryonic kidney cells, whilst modulation of the mutated recombinant receptors was investigated by the two electrode voltage clamp method in Xenopus laevis oocytes. Results indicate that by using four mutations (β3DGE) we were able to introduce a high affinity benzodiazepine binding site into the α1β3 model system. Furthermore, we were able to show that the GABA currents of the mutated recombinant receptors α1β3DG (three mutations), and α1β3DGE, could be modulated by Ro15-1788 and flurazepam.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
GABA GABA-A receptor
Schlagwörter
(Deutsch)
GABA GABA-A Rezeptor
Autor*innen
Anna Lidia Dereky
Haupttitel (Englisch)
Engineering of a Benzodiazepine binding site into GABAA receptors composed of alpha1 and beta3 subunits
Paralleltitel (Deutsch)
Einbau einer Benzodiazepin Bindungsstelle in Rekombinante a1b3 GABA-A Rezeptoren
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
50 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Werner Sieghart
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
44 Medizin > 44.38 Pharmakologie
AC Nummer
AC08192363
Utheses ID
8431
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |
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