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Charakterisierung der Funktion von Proteinbestandteilen in einem aus humanem Plasma isolierten Prothrombinkomplexkonzentrat

Peter Montsch

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Peter Turecek

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30369.09360.870065-1

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Im Zuge dieser Diplomarbeit wurden die hämostatischen Funktionen der einzelnen Bestandteile von einem kommerziell erhältlichen (Baxter BioScience), aktivierten Prothrombinkomplexkonzentrat (APCC) charakterisiert. Dieses Präparat wird zur Behandlung hämophiler Patienten, welche einen Antikörper gegen Faktor VIII oder IX entwickelt haben, eingesetzt. In früheren Arbeiten konnte das APCC in seiner Zusammensetzung analysiert werden. So wurde festgestellt, dass die prokoagulatorischen Proteine (Gerinnungsfaktoren) nur einen relativ kleinen Anteil an der Gesamtproteinmenge ausmachen. Die größte Fraktion im Präparat, mit fast 85%, nehmen andere Plasmaproteine, unter anderem Inter α-Trypsin-Inhibitor (IATI) und Vitronektin (VN) ein. Die prokoagulatorischen Proteine setzen sich unter anderem aus den Zymogenen und ihren aktiven Formen zusammen. Aktivierter Faktor VII (FVIIa) kommt im Vergleich zu den anderen aktivierten Gerinnungsfaktoren im APCC in relativ hoher Konzentration vor. FVIIa stellt einen wesentlichen Teil des exogenen Aktivierungsweges der Blutgerinnung dar und wird ebenfalls in der Therapie der Hämophilie mit Hemmkörper eingesetzt. Weitere, im APCC enthaltene und die Gerinnung beeinflussende, Komponenten sind die Inhibitoren Protein C und sein Co-Faktor Protein S. Aufgrund der zahlreichen Komponenten des APCCs stellt sich die Frage, wie stark die jeweilige Beteiligung, der einzelnen Proteine, an der pharmakologischen Wirkung des APCCs ist. Um diese Problemstellung zu lösen, wurde ein „künstliches“ APCC, durch Mischung der im APCC enthaltenen Gerinnungsfaktoren, hergestellt. Diese Proteine sollten die Funktion des APCCs am stärksten beeinflussen. In einem zweiten Versuchsansatz wurden bei dem Originalpräparat die mengenmäßig dominierenden Proteine, Vitronektin (VN) und Inter α-Trypsin-Inhibitor (IATI), mittels Immun-Affinitätschromatographie (IAC) abgetrennt. So sollte festgestellt werden, inwieweit diese beiden Proteine aufgrund ihrer mengenmäßigen Dominanz und ihrer physiologischen Funktion Einfluss auf die Wirkung des Produktes nehmen. Die Testung der Aktivität erfolgte durch Messung der Thromboplastinzeit (Quick-Wert, TPZ) und der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTZ) und mit Hilfe eines Thrombin Generation Assays (TGA). Die ersten beiden Verfahren sind wichtige diagnostische Instrumente um Störungen der Hämostase festzustellen. Sie erfassen Störungen des exogenen Aktivierungsweges (Thromboplastinzeit) und Störungen des endogenen Aktivierungsweges (aktivierte partielle Thromboplastinzeit). Durch bestimmte Modifikationen können sie auch zur Aktivitätsbestimmung von einzelnen Gerinnungsfaktoren herangezogen werden. Diese beiden Testsysteme simulieren nur den frühen Teil der Gerinnselbildung, nämlich der Bildung von ausreichend Thrombin, um einen Fibrinclot zu bilden. Sie geben dadurch keinen Überblick über die gesamte Blutgerinnung. Der TGA ist ein in vitro Testverfahren zur Bestimmung der Kinetik der Thrombin Bildung. Er zeigt, im Gegensatz zu den zuvor genannten Methoden, auch die Thrombin-Entwicklung nach der Gerinnselbildung an und gibt somit alle Aktivierungs- und Inaktivierungsmechanismen der Thrombin Bildung wieder. Er ist darum ein guter physiologischer Funktionstest zur Beobachtung des hämostatischen und thrombotischen Systems. Um die Kinetik zu messen, wird in einer ex vivo Probe, im plättchenreichen (PRP) oder plättchenarmen Plasma (PPP), bzw. im Vollblut, die Hämostase ausgelöst und die darauf folgenden zeitabhängigen Veränderungen der Thrombin-Konzentrationen werden kontinuierlich detektiert. In dieser Arbeit wird die Thrombin Bildung durch eine niedrig konzentrierte Tissue Factor (TF) – Phospholipid-Lösung in einem Faktor VIII Mangel-Plasma mit einem hochkonzentrierten Faktor VIII Inhibitor ausgelöst. Über den Verbrauch eines fluorogenen Substrats, welches durch, während der Reaktion gebildetes Thrombin, gespalten wird, wird die Thrombin-Konzentration zum jeweiligen Messzeitpunkt berechnet. Zusammenfassung der Vorgangsweise und Ergebnisse Immunaffinitätschromatographie IATI und VN wurden jeweils mittels Affinitätschromatographie vom Originalpräparat abgetrennt. Gleichzeitig hat das Originalpräparat ohne eine Abtrennung von IATI oder VN die Immunaffinitätschromatographie durchlaufen. Dies diente zur Kontrolle, ob das Verfahren der Affinitätschromatographie an sich einen Einfluss auf die Wirkung des Präparates hat. Da bei der Kontrolle die Aktivität abgenommen hat bzw. die Konzentration sämtlicher im Originalpräparat enthaltenen Proteine, konnte rückgeschlossen werden, dass die Chromatographie-Bedingungen das APCC inaktiviert haben. Somit konnte auf diesem Weg nicht beurteilt werden, inwieweit IATI und VN Einfluss auf die Wirkung des APCC nehmen. Künstliches APCC Im künstlichen APCC wurden die einzelnen Faktoren systematisch in verschiedenen Kombinationen und Konzentrationen zusammengefügt, wobei ein Komplex aus Prothrombin (FII) und aktiviertem Faktor X (FXa) – XaII – , welcher laut vorangegangenen Untersuchungen die Hauptwirkung trägt, als Basis gewählt wurde. Um die Anzahl der Kombinationen einzuschränken wurden die Faktoren nach ihrer Funktion im hämostatischen System in verschiedene Gruppen unterteilt. Die eingesetzten Konzentrationen der Faktoren wurden so gewählt, dass sie den Konzentrationen im zu untersuchenden APCC und deren Schwankungen entsprachen. In diesem Ansatz sollte auch der Einfluss von IATI und VN beurteilt werden. Da für die Herstellung des künstlichen APCCs die Ausgangs-Konzentration der Einzelkomponenten relativ hoch sein muss (das künstliche APCC besteht aus insgesamt dreizehn Komponenten und bei jedem Mischungsschritt findet eine Verdünnung statt), und weder IATI noch VN in entsprechend hohen Konzentration erhältlich bzw. verfügbar waren, konnte nicht getestet werden, inwieweit sie Einfluss auf die Wirkung des APCCs nehmen. Bei der Auswertung der Daten des künstlichen APCCs zeigte sich, wie durch frühere Studien belegt, dass der Gerinnungsfaktor II zusammen mit Faktor Xa die Hauptwirkung trägt. Selbst kleinere Konzentrationsveränderungen von FXa lösten, in Gegenwart von FII, bereits eine relativ starke Veränderung in der Thrombin-Bildung (TG) aus. Verglichen mit dem APCC wird dessen Wirkung, solange das molekulare Verhältnis von FXa zu FII dem des APCC entspricht, in Bezug auf die Thrombin-Bildung aber nicht erreicht. Erst durch die gezielte Zugabe sämtlicher im kommerziellen APCC enthaltenen gerinnungsaktiven Proteine konnte ein dem APCC ähnlicher Effekt ausgelöst werden. Die weiteren Zymogene verstärken die Wirkung. Die restlichen aktivierten Faktoren, inklusive FVIIa, haben dagegen kaum einen Effekt. Die Inhibitoren des APCCs gleichen den Überschuss an Gerinnungsfaktoren wieder aus. Somit kann gesagt werden, dass ausschließlich das Zusammenspiel aller prokoagulatorischen Bestandteile des „künstlichen“ APCCs eine dem zu untersuchenden Präparat entsprechende Wirkung hervorrufen kann.

Autor*innen

Peter Montsch

Haupttitel (Deutsch)

Charakterisierung der Funktion von Proteinbestandteilen in einem aus humanem Plasma isolierten Prothrombinkomplexkonzentrat

Publikationsjahr

2010

Umfangsangabe

93 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Deutsch

Beurteiler*in

Peter Turecek

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.30 Naturwissenschaften in Beziehung zu anderen Fachgebieten ,

35 Chemie > 35.13 Reaktionskinetik ,

35 Chemie > 35.74 Enzyme, Hormone, Vitamine ,

44 Medizin > 44.00 Medizin: Allgemeines ,

44 Medizin > 44.38 Pharmakologie ,

44 Medizin > 44.40 Pharmazie, Pharmazeutika ,

44 Medizin > 44.45 Immunologie ,

44 Medizin > 44.51 Diagnostik ,

44 Medizin > 44.78 Immunkrankheiten

AC Nummer

AC08124150

Utheses ID

8474

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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