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Investigation of ACTH response to various stress conditions of mouse AtT-20 pituitaries in vitro by means of Fluorescence Correlation Spectroscopy
Martin Gerald Puchinger
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Gottfried Köhler
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29611.02408.866563-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Herausragende technische Errungenschaften der letzten Jahrzehnte machten Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) zu einer immer wichtigeren Analysetechnik für die Untersuchung supramolekularer Assoziationen, DNS Hybridisierungen, etc. Gerade die Sekretionsrate eines Proteins in einem zentralen Netzwerksystem des menschlichen Körpers live zu verfolgen, war Ziel dieser Arbeit und öffnete einen neuen Anwendungsbereich für FCS, beispielsweise in der medizinischen Diagnostik zur Detektion spezieller Tumor-Marker. Als zentrales Netzwerksystem wurde die Hypothalamus-Hypophyse-Nebennieren (HPA) Achse ausgewählt, der eine Schlüsselrolle im endokrinen Kreislaufsystem bzw. bei endokrinen Erkrankungen des Menschen zukommt. Es wurde der stressinduzierende, stimulierende Effekt von CRH auf die ACTH Abgabe von AtT-20 Hypophysenzellen analysiert. Mit einer eigens entwickelten und auf dem ELISA Prinzip basierten Methode, dem FCS Immunoassay, konnten mit extremer Genauigkeit ACTH Moleküle in Lösung detektiert werden. Die Ergebnisse der ACTH Sekretionsraten in der stationären Phase in vitro strichen besonders die Aktivierung eines non-genomischen Signalweges in AtT-20 Zellen hervor, welcher innerhalb von Sekunden bis Minuten nach Bindung des CRH Moleküls an dessen Membranrezeptor ausgelöst wird. Diese Beobachtungen bestätigen frühere Studien, die eine durch Glucocortciode hervorgerufene Hemmung der ACTH Sekretion zeigen und man daher beim ACTH Ausstoß von ähnlichen Signalwegen für stimulierende und inhibierende Faktoren ausgehen kann. Die erhaltenen Resultate und die daraus abgeleiteten Aussagen zeigen die Sensitivität dieser Technik auf, die sogar kleinste Mengen an Molekülen in Lösung nachweisen kann. FCS ist schneller, kostengünstiger und sensitiver als vergleichbare Fluoreszenz-ELISAs und stellt somit eine ernstzunehmende Alternative dar.
Abstract
(Englisch)
Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) has become a powerful tool for studying supramolecular associations, DNA hybridization reactions, etc. However, monitoring and quantifying the real time release of a protein in a cellular reaction network by means of FCS opens a fundamentally new application of FCS, e.g. in the diagnostic field of medical science, and was the aim of our study. For this purpose the HPA axis network, which plays a key role in the endocrine system of humans, was chosen as a model for our studies. In support of this idea the stimulatory effect of CRH on ACTH release from adherent AtT-20 pituitaries was analysed. Following the idea of ELISA, a FCS Immunoassay was established for detecting ACTH molecules in solution. In vitro real-time FCS measurements have shown that CRH activates a fast non-genomic pathway of ACTH secretion, appearing immediately in a few seconds or minutes after CRH binding to its membrane receptor, beside the genomic one, requiring hours of CRH exposure. These observations are consistent with previous reports showing the glucocorticoid-induced inhibition of ACTH secretion and thus indicating similar pathways for stimulating and inhibiting factors of ACTH secretion. The obtained results and the conclusions that could be made demonstrated the single molecule sensitivity of this solution based technique. We have recently shown that FCS is a powerful spectroscopic tool for detecting even smallest amounts of molecules at a dynamic level and pointed out the advantages of FCS: quicker, more cost-efficient, and more sensitive than commercial fluorescent ELISAs.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
FCS HPA axis AtT-20 cell line Corticotropin (ACTH) Corticoliberin (CRH)
Schlagwörter
(Deutsch)
FCS HPA Achse AtT-20 Zelllinie Corticotropin (ACTH) Corticoliberin (CRH)
Autor*innen
Martin Gerald Puchinger
Haupttitel (Englisch)
Investigation of ACTH response to various stress conditions of mouse AtT-20 pituitaries in vitro by means of Fluorescence Correlation Spectroscopy
Paralleltitel (Deutsch)
In-vitro-Bestimmung der ACTH-Ausschüttung als Antwort auf verschiedene Stressbedingungen in murinen AtT-20 Hypophysenzellen durch Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
110 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Gottfried Köhler
AC Nummer
AC08198034
Utheses ID
8495
Studienkennzahl
UA | 490 | | |