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Culture dependent and -independent identification of microorganisms on monuments
Jörg Dieter Ettenauer
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Werner Lubitz
DOI
10.25365/thesis.9752
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30084.47156.376862-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
In 3.8 Milliarden Jahren Evolution haben Mikroorganismen gelernt sich an alle möglichen Substrate auf der Erde anzupassen (Bunyard et al., 1996). Neben den chemischen und physikalischen Faktoren spielen Mikroorganismen eine entscheidende Rolle bei der biologischen Zerstörung unserer Kulturgüter. Historische Gebäude, Skulpturen und andere Kunstartefakte aus Stein, sowohl historische und moderne werden von Mikroorganismen (Bakterien, Archaea, Pilze, Algen, Flechten, Mose, Pflanzen und höheren Tieren) besiedelt (Ettenauer et al., 2010; Piñar et al., 2001a and 2001b; Heyrman et al., 1999; Schabereiter-Gurtner, 2000; Schabereiter-Gurtner et al., 2001a, 2001b and 2001c).
Um unsere Kulturgüter zu schützen und für unsere Nachkommen zu erhalten, ist es wichtig diese Mikroorganismen zu identifizieren und zu verstehen. Es ist notwendig deren Ursprung, ihre metabolischen Aktivitäten, ihr Einfluss und den Mechanismus der biologischen Zerstörung, die Strukturen der mikrobiellen Gemeinschaften und nicht zu Letzt auch deren Fähigkeiten, die genützt werden können um diese Kunstobjekte zu schützen, näher zu untersuchen.
In vielen Studien wurden die unterschiedlichsten Materialien mit verschiedensten Methoden, die man in Kultivierungs-abhängige und –unabhängige Methoden einteilen kann, untersucht. Mit den unterschiedlichen Techniken erhält man nicht immer kohärente Daten. Generell kann man durch Kultivierung nur etwa 1% der Bakterien einer Umweltprobe identifizieren (Amann et al., 1995; Ward et al., 1990). Trotzdem kann man nur mit Hilfe von Kultivierungsversuchen die metabolischen und physiologischen Eigenschaften von Reinkulturen untersuchen. Die Verwendung von molekularen Methoden erlaubt eine Identifizierung von Mikroorganismen und die kontinuierliche Überwachung von mikrobiellen Gemeinschaften auf Kunstobjekten (Schabereiter-Gurtner et al., 2001b).
Die Methodik die bei dieser Diplomarbeit zur Anwendung kam, besteht aus der Extraktion von DNA aus dem Probenmaterial, gefolgt von der Amplifizierung von Fragmenten der ribosomalen RNA Gene von Bakterien und Archaea durch PCR (Polymerase Ketten Reaktion) und der weiteren Analyse durch DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophosesis). Zusätzlich wurden Techniken, wie die konventionelle Kultivierung von Mikroorganismen, RAPD (Rapid Amplified Polymorphic DNA), die Konstruktion und die Analyse von Klon-Bibliotheken und die phylogenetische Identifizierung der Mikroorganismen durch 16S rDNA Sequenzierung angewendet.
Die Proben der drei durchgeführten Projekte dieser Diplomarbeit, stammten von der Virgilkapelle in Wien und von zwei historischen Gebäuden aus Granada (Spanien) – dem Kloster von San Jéronimo und dem Königlichen Hospiz.
Bei der Charakterisierung den Mikroorganismen, mit Fokus auf salzliebende/-tolerante Vertreter, von Proben der Wiener Kapelle, wurden klassische Kultivierungsversuche als auch molekulare Methoden verwendet. Durch die vergleichende Sequenzanalyse der isolierten Reinkulturen konnten die meisten Bakterien zu den Gattungen Halobacillus und Bacillus eingeordnet werden. Die Vertreter der Archaea waren am nähersten verwandt zu den Gattungen Halococcus, Halalkalicoccus und Halobacterium.
Die Verwendung von Nährmedien mit und ohne Kalziumkarbonat-produzierenden Bakterien als Festigungsmethode für verwitternde Gesteine wurde in vielen Untersuchungen bereits positiv getestet (Rodriguez-Navarro et al., 2003; Jimenez-Lopez et al., 2007, 2008; Gonzalez-Muñoz et al., 2008).
Unter Laborbedingungen wurden die Veränderungen der Bakteriengemeinschaft auf verwittertem und ursprünglichem Steinen in einem Zeitraum von 30 Tagen untersucht, die eine Behandlung mit bzw. ohne Myxococcus xanthus erhielten. Auf beiden Gesteinen konnte man die gleichen Kalziumkarbonat-produzierenden Bakterien nachweisen, nämlich Pseudomonas sp., Bacillus sp. und Brevibacillus sp. Für den Nachweis des als Biomineralisierungsagens verwendete Bakteriums, M. xanthus, über den Zeitraum der Untersuchung wurden DGGE, konventionelle PCR und Real time PCR (qPCR) mit Spezies-spezifischen Primern verwendet. Die Spezies-spezifischen Primer wurden in dieser Studie von Dr. Guadalupe Piñar designt.
Abschließend wurde in dieser Diplomarbeit eine in situ Kurz- und Langzeit-Untersuchung an zwei historischen Gebäuden in Granada (Spanien) durchgeführt. Beide Gebäude erhielten drei unterschiedliche Behandlungen, für die Festigung des Gesteins. Mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden konnte gezeigt werden, dass auf beiden Gebäuden ähnliche Veränderungen in den bakteriellen Gemeinschaften durch die Behandlungen ausgelöst wurden. In der ersten Woche der Behandlung wurden vor allem Vertreter der Stämme Firmicutes und Proteobakterien aktiviert, wohingegen nach einem Jahr die Ordnung der Bacillales (Firmicutes) dominierte.
Abstract
(Englisch)
In 3.8 billion years of evolution microorganisms have learned to adapt to all substrates on earth (Bunyard, 1996). Besides chemical and physical factors, microorganisms inhabiting different stone materials play a key role in the biodeterioration of our Cultural Heritage. Historic buildings, artistic sculptures and other stone works in indoor and outdoor environment as well on modern as on historic objects are colonized by a great variety of organism, including bacteria, archaea, fungi, algae, lichens, mosses, plants and higher organisms (Ettenauer et al., 2010; Piñar et al., 2001a and 2001b; Heyrman et al., 1999; Schabereiter-Gurtner, 2000; Schabereiter-Gurtner et al., 2001a, 2001b and 2001c).
In order to prevent and restore our Cultural Heritage it is important to recognize and understand these microorganisms. It is necessary to gain more insight into their origin, their metabolic activities, their meanings and mechanisms in biodeterioration, the microbial community structures and last but not least the abilities of microorganisms that can be used to protect our objects of art.
In many studies all kind of materials have been investigated using a variety of different methods, grouped into cultivation-dependent and –independent methods, which not always yield coherent data. It is generally accepted that conventional cultivation methods recover less than 1% of all inhabiting bacteria from environmental samples (Amann et al., 1995; Ward et al., 1990). In spite of the disadvantages of standard cultivations assays, physiological and metabolic studies can only be done with pure cultures obtained with the classical approach. On the other hand culture-independent methods have been shown to supply a reliable method to identify and monitor the micro-biota on objects of art (Schabereiter-Gurtner et al., 2001b).
The general methodology used in this study includes as a first step the extraction of DNA from small sample amounts followed by Polymerase Chain Reaction (PCR) directed to amplify fragments of ribosomal RNA genes (16S rRNA) from Bacteria and Archaea and the further fingerprinting of the microbial community using Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). Additionally techniques such as conventional cultivation assays, Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), construction and screening of clone libraries and identification of the microorganisms using 16S rDNA sequencing were applied to perform a monitoring in the three projects presented in this thesis.
Samples subjected to investigation were derived from the Chapel of St. Virgil, Vienna (Austria) and from two ancient buildings located at the city of Granada (Spain) – the Monastery of San Jéronimo and the Royal Hospital.
The investigation performed at the Chapel of St. Virgil, in Vienna, focused on the identification of its inhabiting microorganisms, especially focusing on the halophilic members, by using cultivation assays as well as molecular techniques. Comparative sequence analysis revealed that the majority of the isolated bacterial strains belonged to the genera Halobacillus and Bacillus. Furthermore archaeal clone sequences were identified as members of the genera Halococcus, Halalkalicoccus and Halobacterium.
The investigation performed at the two buildings located in Granada was a part of an international collaboration with the Department of Microbiology at the University of Granada. This working group has a vast experience in the application of carbonatogenic bacteria and/or a sterile-nutritive solution on stone materials to induce a consolidation of the decayed stone materials (Rodriguez-Navarro et al., 2003; Jimenez-Lopez et al., 2007, 2008; Gonzalez-Muñoz et al., 2008).
Under laboratory conditions the dynamics in the microbial community structures on quarry and decayed ornamental carbonate stones, which received a consolidation treatment with Myxococcus xanthus, were investigated during a time scale of 30 days. Irrespectively of the origin of the stone the same carbonatogenic microorganisms were activated, namely Pseudomonas sp., Bacillus sp. and Brevibacillus sp. The monitoring of M. Xanthus during the time course of the experiment was done using DGGE, conventional PCR and qPCR using species-specific primers designed in this study (by Dr. Guadalupe Piñar).
As follow-up of this investigation, the microbial community structure of two historic buildings in Granada (Spain), which received three different treatments in situ for the consolidation of the stone, was monitored. We performed a short-term (for a period of a week) and a long-term molecular monitoring (for a period of one year) of the changes in the microbial communities occurring during and after the application of the treatments in order to evaluate the impact of such consolidation treatments. Results revealed that similar dynamics of the inhabiting micro-biota were initiated on both buildings by the applications. In the first week members of the phyla Firmicutes and Proteobacteria became activated, whereas after one year on the treated areas the order Bacillales (Firmicutes) represented the dominant group of microorganisms.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Identification of microorganisms PCR DGGE RAPD
Schlagwörter
(Deutsch)
Identifikation von Mikroorganismen PCR DGGE RAPD
Autor*innen
Jörg Dieter Ettenauer
Haupttitel (Englisch)
Culture dependent and -independent identification of microorganisms on monuments
Paralleltitel (Deutsch)
Kultivierungsabhängige und -unabhängige Identifikation von Mikroorganismen auf Denkmälern
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
222 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Werner Lubitz
AC Nummer
AC08209536
Utheses ID
8800
Studienkennzahl
UA | 441 | | |