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Gene regulation of φCh1
characterization of ORF49 and further characterization of the origin of replication of the halophage φCh1
Michael Reiter
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Angela Witte
DOI
10.25365/thesis.9783
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30011.79253.681269-0
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der Halophage φCh1 infiziert das haloalkalophile Archaeon Natrialba magadii. Der Replikationsursprung von φCh1 besteht aus zwei offenen Leserahmen (ORFs). Beide Leserahmen (ORF53 und ORF54) ähneln RepH, einem Faktor der für die Replikation des Haloarcula marismortui Plasmids pNRC100 eine große Rolle spielt. ORF53 und ORF54 werden gemeinsam von AT-reichen, palindromischen Sequenzen flankiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde durch Einführen einer Mutation, welche den Leserahmen der Gene verschiebt, gezeigt, dass beide ORFs für die Replikation eines Shuttle Vectors innerhalb von Nab. magadii notwendig sind. Durch die Deletion der 5´ sowie der 3´ AT-reichen Sequenzen konnte auch gezeigt werden, dass die 3´ Sequenz eine größere Rolle spielt, wenn nur jeweils eine der beiden Sequenzen deletiert ist. Gleichzeitige Deletion beider Sequenzen stellt allerdings das normale Replikationsverhalten wieder her, was auf einen bisher unbekannten Replikationsmechanismus hindeutet.
In dieser Arbeit konnte weiters gezeigt werden, dass gp49 aus φCh1 als starker Repressor für dieses Virus fungiert. Mittels Deletionsmutagenese konnte die aktive Domäne des Proteins auf die ersten 81 von insgesamt 117 Codons festgelegt werden. Darüberhinaus wurde gp49 mittels eines E. coli Expressionsvektors erfolgreich aufgereinigt. Damit konnte ein EMSA zum Nachweis der DNA-Bindungsaktivität von gp49 durchgeführt werden. Weitere Bindungsstudien mit verkürzten Versionen von gp49 ergaben, dass C-terminale Deletionen keinen Effekt auf die DNA-Bindungsaktivität haben, während die Repressoraktivität zerstört wird. Werden hingegen die ersten 52 N-terminalen Codons deletiert, geht die Bindungsaktivität verloren. Dies impliziert, dass gp49 aus mindestens zwei funktionellen Domänen besteht, einer Domäne, die für die
DNA-Bindung verantwortlich ist und einer Domäne, welche die Aktivität des Proteins vermittelt.
Abstract
(Englisch)
The phage φCh1 infects Natrialba magadii, a haloalkaliphilic archaeon. The φCh1 origin of replication consists of two open reading frames (ORF53 and ORF54) similar to RepH, a protein required for replication of plasmid pNRC100 of Haloarcula marismortui. ORF53 and ORF54 together are flanked by AT rich palindromic sequences.
In this thesis introduction of frameshift mutations into either ORF53 or ORF54 revealed the absolute requirement for both ORFs for replication of a shuttle vector within Nab. magadii. By subsequent deletion of the 3´ as well as the 5´ AT rich regions the 3´ region was found to be more important for replication if only one of these two sequences is deleted. However, deleting both sequences has no effect on replication suggesting a so far unknown mechanism of replication.
Furthermore the present work confirmed gp49 being a strong repressor of φCh1. By deletion mutagenesis the active domain of gp49 activity was mapped to comprise the first 81 of altogether 117 codons. Furthermore gp49 could be successfully purified from an E. coli expression vector. Thus an EMSA could be performed identifying gp49 as DNA-binding protein. Binding studies with truncated forms of gp49 revealed that C terminal truncations have no effect on DNA-binding whereas repressor activity is lost. On the other hand an N-terminal deletion of the first 52 codons leads to the abolishment of the DNA binding activity. These data suggest that gp49 is comprised at least of two domains, one of which being responsible for binding the other mediating the repressor activity.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Archaea haloalkaliphile alkaliphile halophile Haloarchaea φCh1 EMSA Bandshift ori origin replication deletion mutagenesis repH Natrialba magadii shuttle vector
Schlagwörter
(Deutsch)
Archaea haloalkalophil alkalophil halophil Haloarchaea φCh1 EMSA Bandshift Replikationsursprung Deletion Deletionsmutagenese repH Natrialba magadii shuttle vector
Autor*innen
Michael Reiter
Haupttitel (Englisch)
Gene regulation of φCh1
Hauptuntertitel (Englisch)
characterization of ORF49 and further characterization of the origin of replication of the halophage φCh1
Paralleltitel (Deutsch)
Genregulation bei φCh1 ; Charakterisierung des ORF49 und weitere Charakterisierung des Replikationsurprunges des Halophagen φCh1
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
121 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Angela Witte
AC Nummer
AC08210204
Utheses ID
8827
Studienkennzahl
UA | 441 | | |