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Correlating structure and dynamics of lamellipodia and determination of the F-and G-actin concentrations in lamellipodia

Stefan Köstler

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

John Victor Small

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DOI

10.25365/thesis.1212

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30085.62871.830066-6

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

TITELBLATT: nur in PRINTAUSGABE! -- Eukaryotische Zellen bewegen sich in Phasen des Schiebens und Ziehens einer flachen Struktur an der Zell-Vorderseite, dem Lamellipodium. Die Vorwärtsbewegung entsteht durch die Polymerisation von Aktin-Monomeren (G-Aktin) in Aktin-Filamente (F-Aktin) am vorderen Rand des Lamellipodiums, wodurch die Membran nach vorne geschoben wird. Aktin-Filamente werden in Richtung zum hinteren Ende des Lamellipodiums abgebaut wodurch ein Vorrat an Aktin-Monomeren aufrecht erhalten wird. Im Laufe meiner Doktorarbeit habe ich mittels korrelativer Licht- und Negativ-Färbungs-Elektronenmikroskopie anhand von B16 Maus Melanomzellen, die mit GFP-Aktin und anderen Konstrukten, die Zellbewegungsproteine kodieren, den Zusammenhang zwischen den unterschiedlichen Aktivitäten des Lamellipodiums und seiner Ultrastruktur untersucht. Ich konnte zeigen, dass sich die Aktinfilamente während des Übergangs vom Schieben zum Ziehen neu anordnen um zusammen mit Myosin hinter dem Lamellipodium kontraktile Einheiten aus antiparallen Filamenten zu bilden. Die Ergebnisse stellen derzeitige Modelle für die Zellbewegung mittels Aktin infrage. Außerdem haben wir eine Methode entwickelt um die F- und G-Aktin-Konzentrationen im Lamellipodium von sich bewegenden Zellen zu bestimmen. Die Strategie war zunächst das Verhältnis von F- zu G-Aktin zu ermitteln. Dazu haben wir die Möglichkeiten von FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching - das Wiedererlangen der Fluoreszenz nach Bleichen mit starkem Licht.) genutzt um die F- und G-Aktin-Komponenten der gesamten Fluoreszenzintensität räumlich zu trennen um dann die G-actin-Komponente durch Zell-Lyse zu erhalten. Die F-actin Konzentration wurde von Elektronenmikroskopiebildern ermittelt. Die Konzentrationsparameter können in mathematische Modelle inkorporiert werden und haben Auswirkungen auf die Art, wie Zellbewegung reguliert wird. Zusammenfassend haben die Studien neue Erkenntnisse über die Dynamik der Aktin-Filamente während der Zellbewegung geliefert.

Abstract

(Englisch)

Eukaryotic cells move in phases of extension and retraction of a leaf-like structure, the lamellipodium, at the cell front. Protrusion occurs by the polymerization of monomeric (G) into polymeric (F) actin filaments at the tip of the lamellipodium, thereby pushing the membrane forward. Actin filaments are depolymerized towards the rear of the lamellipodium in a treadmilling process, thereby supplementing a G-actin pool for a new round of polymerization. During my thesis I used correlative light cell imaging and negative stain electron microscopy on B16 mouse melanoma cells transfected with GFP-actin and other constructs encoding cell motility proteins to determine the correlation between the protrusive activity and the ultra-structure of the lamellipodium. I show that during a shift from protrusion to retraction lamellipodial filaments rearrange to generate, together with myosin, contractile arrays of antiparallel filaments behind the lamellipodium. The results challenge current models of how actin filaments are used to drive protrusion. Moreover, I developed a technique to determine the F- and G-actin concentrations in lamellipodia of living cells. The strategy was to first determine the F- to G-actin ratio by exploiting the light microscopy technique FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) to spatially segregate the F- and G-actin components of the total fluorescence intensity and specifically extract the G-actin component by cell lysis. The F-actin concentration was determined from electron micrographs. The concentration parameters can be incorporated into mathematical models and have implications on the way protrusion is regulated. In conclusion these studies have provided new information about the dynamics of actin filament turn-over during cell migration.

Autor*innen

Stefan Köstler

Haupttitel (Englisch)

Correlating structure and dynamics of lamellipodia and determination of the F-and G-actin concentrations in lamellipodia

Paralleltitel (Deutsch)

Korrelation von Struktur und Dynamik des Lamellipodiums

Publikationsjahr

2008

Umfangsangabe

83 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Friedrich Probst ,

Graham Dunn

Klassifikation

42 Biologie > 42.15 Zellbiologie

AC Nummer

AC05038693

Utheses ID

933

Studienkennzahl

UA | 091 | 441 | |

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