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Development of novel methodological approaches to detection and quantitative monitoring of point-mutated clones
Sandra Preuner
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Angela Witte
DOI
10.25365/thesis.10335
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29392.29218.183670-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Bei Patienten mit chronisch myeloischer Leukämie (CML) ist das Auftreten von Punktmutationen in der BCR-ABL1 Tyrosinkinasedomäne (TK) die am häufigsten beschriebene Ursache für Resistenzen gegen Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI). Für die Detektion von Punktmutationen ist eine Auswahl an Methoden verfügbar. Diese sind jedoch oft wenig sensitiv, wie zum Beispiel die Standardmethode der bidirektionalen Sequenzierung, mit einer Sensitivität von circa 20%. Das Auftreten von TKI resistenten Zellklonen muss jedoch nicht notwendigerweise mit einer bevorstehenden Progression der Krankheit assoziiert sein. Die Analyse von mutanten Zellklonen mit qualitativen Methoden könnte daher unzureichend sein, um klinisch relevante Klone zu identifizieren. Um diese Problematik bearbeiten zu können, wäre eine Methode von Vorteil, die die Detektion von Punktmutationen in einem klinisch relevanten Bereich mit der Möglichkeit zur Quantifizierung vereint. Solch eine Methode galt es zu entwickeln. Die neu etablierte LD-PCR Methode basiert auf der Hybridisierung spezifischer Sonden an die Wildtyp (WT) bzw. mutierte Sequenz gefolgt von einer ligations-abhängigen kompetitiven PCR. Die generierten Amplikons werden mittels Kapillarelektrophorese detektiert und quantifiziert. LD-PCR Assays wurden für folgende 21 häufig vorkommenden BCR-ABL1 TK Punktmutationen etabliert: M244V, L248V, V299L-C/T, G250E, Q252H-C/T, Y253F, Y253H, E255K, T315A, T315I, F317C, F317I, F317L-A/G, F317V, M351T, F359V, H396P and H396R. Das Konzept der LD-PCR ist auf jegliche Punktmutation umlegbar, wie am Beispiel der Punktmutation V617V im JAK2 Gen, die bei myeloproliferativen Erkrankungen prognostisch bedeutend ist, gezeigt werden konnte. Die LD-PCR Assays haben eine Sensitivität von 1-5% und ermöglichen eine quantitative Überwachung während des Behandlungsverlaufs.
Die Anwendbarkeit dieser Methode bei CML Patienten unter TKI Behandlung konnte ebenso gezeigt werden wie das Vorhandensein einer Proliferationskinetik mutierter Zellklone. Die Dokumentation der Größe und der Expansion eines mutierten Zellklons könnte die Vorhersage einer bevorstehenden Resistenz ermöglichen und bei der klinischen Überwachung sowie bei der Therapiesteuerung von CML Patienten hilfreich sein.
Abstract
(Englisch)
In patients with chronic myeloid leukemia (CML), the occurrence of point mutations within the BCR-ABL1 tyrosine kinase (TK) domain is currently the most common mechanism of resistance to therapy with TK inhibitors. To date a variety of different techniques to the detection of relevant point mutations is available. This mainly includes methods displaying a limited level of sensitivity e.g. bidirectional sequencing, the standard method of choice, providing a sensitivity of ~ 20%. However, the presence of cells carrying resistant mutations does not necessarily imply imminent disease progression. Mutation analysis by qualitative methods may therefore be insufficient to reliably identify clinically relevant resistant clones. To address this problem, an application permitting the detection of point mutated subclones of clinically relevant size and the additional option for quantitative analysis might be of great benefit. Thus the aim was to establish a technique combining both requirements. The newly developed LD-PCR relies on specific probe hybridization to mutant and wild-type sequences followed by ligation-dependent competitive PCR. Amplicons are detected and quantified via fluorescence-based capillary electrophoresis. Assays have been established for 21 common BCR-ABL1 TK point mutations including M244V, L248V, V299L-C/T, G250E, Q252H-C/T, Y253F, Y253H, E255K, T315A, T315I, F317C, F317I, F317L-A/G, F317V, M351T, F359V, H396P and H396R. Moreover the technique is adaptive to any kind of point mutation as shown for the detection of V617F point mutation within the JAK2 gene, relevant for several myeloproliferative disorders. The LD-PCR assays display a detection limit of 1-5% and permit quantitative monitoring of mutant clones during the course of treatment. The applicability in CML patients undergoing treatment with TK inhibitors and the existence of kinetic proliferation of mutated cells clones could be demonstrated. Assessment of the size and proliferation kinetics of clones carrying specific mutations could therefore be instrumental in the clinical surveillance and therapeutic management of CML patients.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
point-mutated clones CML quantitative monitoring
Schlagwörter
(Deutsch)
punktmutierte Klone CML quantitatives Monitoring
Autor*innen
Sandra Preuner
Haupttitel (Englisch)
Development of novel methodological approaches to detection and quantitative monitoring of point-mutated clones
Paralleltitel (Deutsch)
Entwicklung neuer methodischer Ansätze für die Detektion und die quantitative Überwachung punktmutierter Klone
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
110 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Angela Witte
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
44 Medizin > 44.48 Medizinische Genetik
AC Nummer
AC08253916
Utheses ID
9334
Studienkennzahl
UA | 441 | | |