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Reaction of the human parasite Entamoeba histolytica to metronidazole

mRNA expression analysis based on a compilation of annotation data from the genome project

Margit Helga Tazreiter

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Michael Duchêne

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DOI

10.25365/thesis.10363

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29448.09138.322254-0

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Das Ziel dieser Dissertation war die Untersuchung der Reaktion des mikroaerophilen einzelligen Parasiten Entamoeba histolytica auf die Behandlung mit dem klassischen Chemotherapeutikum Metronidazol auf mRNA-Ebene mithilfe von Oligonucleotid-Microarrays. Basierend auf dem E. histolytica – Genomprojekt erstellten wir zuerst drei Datenbanken, die die Annotation von aktuell 1334 Enzymen, 222 Zytoskelettgenen sowie 117 Stressgenen und Redox-Faktoren beinhalten. Wir fanden viele Gene, die möglicherweise bakteriellen Ursprungs sind, und etablierten einen Überblick über die in E. histolytica vorhandenen Stoffwechselwege. In einem zweiten Schritt verwendeten wir unsere Datenbanken für das Design von Oligonucleotid-Proben für unseren Microarray. Um die Reaktion von Amöben auf Metronidazol zu untersuchen, verwendeten wir Zellen von E. histolytica HM-1:IMSS, die für 1 h, 3 h oder 5 h mit jeweils 50µM Metronidazol behandelt wurden, sowie Kontroll-Zellen. Die fluoreszenzmarkierte cDNA dieser Proben wurde auf unseren fokussierten, 213 Gene representierenden Microarray hybridisiert und die Daten wurden ausgewertet. Erstaunlicherweise änderte sich die Menge der transkribierten mRNAs von E. histolytica durch die Metronidazol-Behandlung nur sehr geringfügig. Bei 15 Genen kam es zu einer zumindest teilweisen Erhöhung der Transkriptionsrate, nur sieben davon wiesen zumindest einen Wert mit einer signifikanten Erhöhung ≥2 auf. Dies waren Superoxiddismutase (SOD), Peroxiredoxin, zwei Ferredoxin-Gene, leichte- und schwere Ketten des Gal/GalNAc-spezifischen Lektins, sowie eine Fettsäure-CoA-Ligase mit Spezifität für lange Ketten. Bei acht Genen wurde ein leichtes Herunterfahren der Transkription gefunden, wobei der Wert bei sechs Genen signifikant auf ≤0,5 fiel. Dies waren ein Actin, das 101 kDa Hitzeschockprotein, eine kurzkettige Dehydrogenase, eine Fettsäure-Elongase, das sogenannte "diaphanous"-Protein sowie ein "WD-repeat"-Protein. Zur Überprüfung unserer Ergebnisse führten wir für sieben Gene auch quantitative "real time RT-PCR" durch, welche die Microarray-Daten bestätigte. In einer parallel laufenden Dissertation wurden die Veränderungen auf Protein-Ebene mithilfe von zweidimensionalen Gelen untersucht. Auch hier konnte bei keinem Protein eine signifikante Änderung der produzierten Menge aufgrund von Metronidazol-Einfluss gefunden werden. Alledings kam es zu Modifikationen bei fünf bestimmten Proteinen aufgrund der Anlagerung von reduzierten Metronidazol-Metaboliten (Leitsch et al., 2007). Zusammenfassend gesehen reagierten E. histolytica-Zellen auf die Einwirkung von Metronidazol nur mit einer sehr geringen Anpassung der Transkription, nur wenige Gene wurden signifikant hinauf- oder hinunterreguliert. Einige dieser hochregulierten Gene (SOD, Peroxiredoxin, Thioredoxin und Thioredoxinreduktase) schützen die Amöbenzellen gegen oxidativen Stress, der von reduziertem Metronidazol verursacht wird. Das Gesamtbild zeigt Amöbenzellen, die zu keiner konzertierten sinnvollen Reaktion gegen Metronidazol imstande sind und auch die Aktivierung des Metronidazols nicht verhindern können.

Abstract

(Englisch)

The objective of this PhD thesis was to investigate the reaction of the microaerophilic protist parasite Entamoeba histolytica to the standard chemotherapeutical agent metronidazole on the gene expression level with the help of oligonucleotide microarrays. On the basis of early data from the E. histolytica genome project we first compiled three annotation databases currently containing genes encoding enzymes (1334 entries), cytoskeleton proteins (222 entries), and stress genes and redox factors (117 entries). We found a number of genes with an assumed bacterial origin and established an overview about metabolic pathways present in the E. histolytica genome. In a second step we used our databases for the construction of oligonucleotide probes for our microarray. To investigate the reaction of amoebae to metronidazole we used cells of E. histolytica HM-1:IMSS treated with 50µM of metronidazole for 1 h, 3 h and 5 h, respectively, and untreated control cells. Fluorescently labeled cDNAs from these cells were hybridized to our focussed array representing 213 genes, and the data were analysed. The transcriptional response of E. histolytica to metronidazole treatment was unexpectedly modest, with 15 genes at least partly upregulated. Only seven showed at least one value with a statistically significant fold change ≥2. These were superoxide dismutase (SOD), peroxiredoxin, two ferredoxin genes, the Gal/GalNAc specific lectin light and heavy chains and a long chain fatty acid CoA ligase. Modest down-regulation was found with eight genes, with six genes showing at least one time point with significant downregulation ≤ 0.5. These were genes encoding an actin isoform, the 101 kDa heat shock protein, a short chain dehydrogenase, a fatty acid elongase, diaphanous protein and a WD repeat protein. We used quantitative real time RT-PCR to verify these transcriptional changes for seven selected genes, and these results confirmed our microarray data. In a parallel PhD thesis the changes in protein levels were monitored with the help of 2DE gels. There again no significant up- or down-regulation of protein levels was found under metronidazole influence, but a modification of five distinct proteins by reduced metronidazole metabolites (Leitsch et al., 2007). Taken together, the response of E. histolytica to metronidazole treatment on the mRNA level was rather modest, with only a few genes up- or down-regulated significantly. Several of these upregulated genes (SOD, peroxiredoxin, thioredoxin and thioredoxin reductase) protect the amoeba cells against oxidative stress that is generated by reduced metronidazole. But on the whole, E. histolytica appears to be unable to mount a strong specific response to inactivate metronidazole, or to prevent its activation.

Autor*innen

Margit Helga Tazreiter

Haupttitel (Englisch)

Reaction of the human parasite Entamoeba histolytica to metronidazole

Hauptuntertitel (Englisch)

mRNA expression analysis based on a compilation of annotation data from the genome project

Paralleltitel (Deutsch)

Konstruktion eines Oligonucleotidmicroarrays auf der Basis von Daten des Entamoeba histolytica Genomprojekts und Untersuchung der mRNA Expression der Amöben unter Metronidazoleinwirkung

Publikationsjahr

2010

Umfangsangabe

105 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Graham Clark ,

Julia Walochnik

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.36 Parasitologie

AC Nummer

AC07806893

Utheses ID

9361

Studienkennzahl

UA | 091 | 441 | |

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Schlagwörter