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Signalling in space and time
catching dynamic interactions using a novel enzymatic tagging approach in the S. cerevisiae HOG pathway
Christina Friedmann
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Gustav Ammerer
DOI
10.25365/thesis.10365
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29514.43434.934659-9
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Signaltransduktion ist ein wichtiger zellulärer Prozess, der durch schnelle und exakte Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) eine zelluläre Antwort auf verschiedenste Umweltbedingungen, und somit das Überleben der Zelle ermöglicht. In dieser Dissertation versuchten wir mehr über PPIs und im Speziellen über ihre transienten Veränderungen während der Signaltransduktion von Osmostress in S. cerevisiae herauszufinden. Der Osmostresspathway besteht aus zwei funktionell redundanten Zweigen und bedient sich einer mitogenaktivierten Proteinkinasenkaskade (MAPK Kaskade), welche auch zentrales Element für weitere Stresssignaltransduktionen ist . Unser spezielles Augenmerk galt hier der Interaktion von Membranproteinen und cytoplasmatischen Proteinen, daher entwickelten wir eine neue Methode, die auf einer enzymatischen Reaktion zwischen zwei potentiellen Interaktionspartnern basiert. Dieser Assay beruht auf einer Histonmethyltransferase (HMT) und seinem Substrat, einem 20 Aminosäuren großen Teil des Histons H3. Dieses System hat sich als ein in vitro assay erwiesen, der es ermöglicht, transiente Veränderungen von Proteininteraktionen aufzuzeigen.
Mit Hilfe dieser Methode konnten wir aufzeigen, dass sich unter Osmostress die Interaktion des Membranproteins Sho1 und der MAPKKK Ste11 verstärkt, und dass dieses Signal in Stämmen, die das Osmostresssignal nicht weiterleiten können (Δpbs2, Δhog1), weiter verstärkt wird. Außerdem hängt diese Interaktion von Ste50, dem Adaptorprotein von Ste11, und den Osmosensoren Msb2 und Hkr1 ab. Es konnte jedoch kein Einfluss des membrangebundenen Adaptorproteins Opy2 nachgewiesen werden. Weiters entdeckten wir, dass die Affinität von Sho1 und der MAPKK Pbs2 unter Osmostress reduziert ist, was die Dissoziation des Sho1-Pbs2-Komplexes widerspiegeln könnte.
Außerdem untersuchten wir, wie, obwohl die gleichen Proteine von mehreren Signaltransduktionskaskaden gebraucht werden, pathway-crosstalk vermieden werden kann. Wir entdeckten, dass die Expression von Fus1, ein für die Zellfusion benötigtes Protein, den Osmostress-pathway durch die Erniedrigung von Sho1-Proteinlevels negativ beeinflusst.
Letztlich studierten wir negative Regulation der Signaltransduktion mit dem Fokus auf dem Adaptorprotein Nbp2, welches die Phosphatase Ptc1 zum Pbs2/Hog1-Komplex rekrutiert. Wir zeigten, dass Nbp2 nicht nur als negativer Regulator für Osmostresssignaltransduktion dienen könnte, sondern auch einen positiven Effekt, möglicherweise durch die negative Regulation anderer MAPK Kaskaden, auf ihn haben könnte.
Abstract
(Englisch)
Signalling is an important cellular process that requires fast and accurate protein interactions to efficiently transmit signals that ultimately lead to a cellular response, ensuring cell survival. Furthermore, the constant changes of environmental conditions raise the need for a cell to be able to transiently alter signal transduction and protein-protein interactions (PPIs). In this work we try to gain more insight into PPIs and the transient changes in signal transduction in the osmostress pathway of S. cerevisiae. The osmostress pathway is composed of two functionally redundant branches, and employs a mitogen activated protein kinase (MAPK) cascade, a central component of stress signalling. We particularly focussed our studies on transient protein-protein interactions occurring between membrane bound proteins and cytoplasmic proteins. Therefore, we developed a new protein interaction assay based on an enzymatic reaction between the two potential interaction partners. This method relies on a mammalian histone methyl transferase (HMT) and a 20 amino acid stretch of its substrate histone H3 protein. This system proved to be an in vivo protein interaction assay capable of catching transient changes of interaction rates of signalling proteins.
Using this assay we discovered that the interaction of the membrane protein Sho1 and the MAPKKK Ste11 increases upon osmostress and that this interaction is enhanced in strains incapable of downstream signalling (Δpbs2, Δhog1). Furthermore this interaction depends on Ste50, an adaptor for Ste11, and the osmosensors Msb2 and Hkr1. However, this interaction was found to be independent of the membrane bound adaptor protein Opy2. Additionally, we discovered that the affinity of Sho1 and the MAPKK Pbs2 decreases upon pathway activation, which may reflect the dissociation of the Sho1-Pbs2 complex.
We also investigated how pathway crosstalk is avoided, for the same proteins are shared in different signal transduction pathways. We confirmed that Fus1, a protein necessary for cell fusion during mating, negatively regulates the HOG pathway by interacting with Sho1 and possibly by effecting its expression levels.
Finally, we investigated negative regulatory elements of signal transduction, focussing on the adaptor protein Nbp2, a protein recruiting the phosphatase Ptc1 to the Pbs2/Hog1 complex. We showed that Nbp2 may not exclusively act as a negative regulator for the osmostress signalling cascade, but may also have a positive influence on the HOG pathway, possibly via regulating other MAPK cascades as well.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
S. cerevisiae HOG-pathway protein-protein-interaction
Schlagwörter
(Deutsch)
S. cerevisiae HOG-pathway protein-protein-interaction
Autor*innen
Christina Friedmann
Haupttitel (Englisch)
Signalling in space and time
Hauptuntertitel (Englisch)
catching dynamic interactions using a novel enzymatic tagging approach in the S. cerevisiae HOG pathway
Paralleltitel (Deutsch)
Signalling in Raum und Zeit ; über das Einfangen dynamischer Interaktionen mittels einer neuen enzymatischen tagging Methode im HOG pathway von S. cerevisiae
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
112 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Egon Ogris ,
David Levin
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften
AC Nummer
AC08258265
Utheses ID
9363
Studienkennzahl
UA | 091 | 441 | |