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Investigation of high-performance liquid chromatography methods for the analysis of protein N-glycans

Michael Melmer

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Chemie

Betreuer*in

Wolfgang Lindner

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DOI

10.25365/thesis.10519

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29866.25806.934553-0

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Biopharmazeutika sind aus einigen Bereichen der modernen Medizin kaum noch wegzudenken. Während die Herstellung vergleichsweise einfacher Biomoleküle, wie z.B. des Peptids Insulin, mittlerweile Routine ist, stellt die Expression komplexer Proteine immer noch eine große Herausforderung für die Biotechnologie bzw. die biopharmazeutische Industrie dar. Oft sind posttranslationale Modifikationen der Proteine erforderlich, damit diese eine entsprechende Wirkung zeigen. Glykosylierung ist eine der häufigsten post-translationalen Modifikationen in eukaryotischen Zellen. Deshalb ist es nicht überraschend, dass auch Glykoproteine als Biopharmazeutika Anwendung finden, wie z.B. Erythropoietin, Interferone, Fibrinogen, sowie eine Reihe von monoklonalen Antikörpern. Dass die Glykosylierung Einfluss auf die Wirksamkeit und auch die Verträglichkeit hat, ist gut dokumentiert. Da die Glykosylierung von Proteinen im Gegensatz zur Protein- und zur Nukleinsäurebiosynthese nicht nach einer Vorlage erfolgt, sondern durch das Zusammenspiel einer Vielzahl an Enzymen zustande kommt, weist sie in der Regel eine recht heterogene Zusammensetzung auf. Die vorkommenden Glykane, sowie deren Verhältnisse sind wichtige Parameter, die analysiert werden müssen um die Stabilität des Herstellprozesses, sowie die Sicherheit und Wirksamkeit des Produkts sicherzustellen. Für die Analyse der Glykosylierung kommen eine Reihe von Analysemethoden zur Anwendung, wobei die Analyse von freien, mit Fluoreszenzfarbstoff gelabeleten Glykanen mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie (high-performance liquid chromatography, HPLC) als Referenzmethode gilt. Als stationäre Phasen stehen Umkehrphasen (reversed phase chromatography, RPC), hydrophile Wechselwirkungsphasen (hydrophilic interaction chromatography, HILIC) und poröser, graphitähnlicher Kohlenstoff (porous graphitic carbon, PGC) zur Verfügung. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag auf der letztgenannten Option. Zwei Publikationen befassen sich mit dem Retentionsmechanismus von Oligosacchariden auf PGC. Die Untersuchungen zeigen, dass das organische Lösungsmittel in der mobilen Phase den Wechselwirkungsmechanismusstark beeinflusst. Besondere Eigenschaften weist vor allem Acetonitril auf. Weiters wurde der Einfluss der Temperatur des Säulenofens als wichtiger Parameter für die Selektivität identifiziert. Schließlich wird der Effekt von Oxidations- und Reduktionsmitteln - 92 - auf die Retention von neutralen Glykanen gezeigt. Die Oxidation von PGC verhinderte außerdem die Elution eines sauren Glykans vollständig, was für eine Polarisation der Oberfläche durch das Reagens spricht. Die Auswirkungen der Reduktions- und Oxidationsmittel wird in der zweiten Publikation ausführlich diskutiert. Eine weitere Publikation beschäftigt sich mit der Etablierung einer vollständigen Analysemethode für Glykane von therapeutischen Antikörpern. Die Glykane werden enzymatisch abgespalten, mit einem Fluoreszenzfarbstoff gelabelts, mittels HILIC getrennt und durch Fluoreszenzdetektion quantifiziert. Besondere Aufmerksamkeit lag auf der Probenvorbereitung, die mehrere Schritte umfasst und dahingehend optimiert wurde die Integrität der ursprünglichen Verhältnisse der Glykane zu erhalten. Die Methode wurde für den Einsatz in der pharmazeutischen Industrie validiert. Die Daten zur Reproduzierbarkeit der Methode zeigten nur unwesentliche Abweichungen zwischen unterschiedlichen Operatoren in verschiedenen Labors. Außerdem zeigte sich, dass die Daten dieser Analysemethode mit den Ergebnissen einer orthogonlen Analysemethode, nämlich der RPC-Analyse der (Glyko-)Peptide, übereinstimmen, was die Korrektheit der Quantifizierung bestätigt. Schließlich werden in der vierten Publikation die Eigenschaften von RPC, HILIC und PGCChromatographie in Hinblick auf die Trennung von fluoreszenz-gelabelten Glykanen verglichen. Hierfür wurde ein breites Set von high-mannose und complex Glykanen auf diesen stationären Phasen chromatographiert und die generierten Retentionsdaten verglichen. Weiters wurden die Retentionszeiten mittels multipler linearer Regression (MLR) mit der Monosaccharidzusammensetzung korreliert. Im Gegensatz zu RPC und HILIC konnte für PGCChromatographie kein adäquates Modell gefunden werden, was dafür spricht, dass die Retentionszeiten von Glykanen auf PGC nicht allein durch deren Zusammensetzung determiniert sind.

Abstract

(Englisch)

Biopharmaceuticals are nowadays indispensable tools of the modern medicine. The production of basic biomolecules (e.g. insulin) counts as routine, but the expression of complex proteins is still a major challenge for biotechnology and the biopharmaceutical industry. Often post-translational modifications are a prerequisite for the proper function of the product. Glycosylation is one of the most common post-translational modifications in eukaryotic cells. Several glycoproteins are being used as biopharmaceuticals, e.g. erythropoietin, interferons, fibrinogen and a number of monoclonal antibodies. The impact of the glycosylation on efficacy and safety is well documented in the literature. Since the glycosylation of proteins is not driven by a template, but the result of the activities of many enzymes it typically exhibits a very heterogenic pattern. The individual glycan structures and their quantitative ratios are important parameters, which have to be determined to demonstrate the consistency of the production process, as well as the safety and efficacy of the final product. Several methods are employed for the analysis of protein glycosylation. High-performance liquid chromatography (HPLC) of fluorescence labeled glycans serves as a reference method due to the straight-forward quantitation utilizing the fluorescence signal. Typically reversed-phase chromatography (RPC), hydrophilic-interaction chromatography (HILIC) or porous graphitic carbon (PGC) chromatography are applied for the separation of glycans. This thesis focuses on PGC. Hence two publications investigate the retention mechanism of oligosaccharides on PGC. The experiments revealed that the nature of the organic solvent in the mobile phase significantly impacts the retention mechanism. Particularly acetonitrile offers unique properties for the separation of glycans on PGC. The column temperature was identified as important parameter for the selectivity. Furthermore the effect of oxidizing and reducing agents on the retention of neutral glycans were demonstrated. Oxidation of PGC impeded the elution of an acidic glycan, which indicates that the stationary phase was polarized. The phenomena generated by oxidation and reduction of PGC are thoroughly discussed in the second publication. A further publication describes the development and evaluation of an analysis method for monoclonal antibody (mAb) glycans. The glycans were released from the protein by enzymatic means and subsequently labeled with a fluorescence dye. The glycans were separated on a HILIC - 90 - column and quantified by the fluorescence signal. The sample preparation procedure was optimized in respect to maintaining the original glycan pattern. The final analysis method was validated for the use in the biopharmaceutical industry. Reproducibility data exhibited only marginal differences between the results reported by different technicians from several laboratories. Furthermore the data were affirmed by an orthogonal method, namely RPC analysis of (glyco-)peptides (peptide mapping) with MS detection. In a fourth publication the retention properties of RPC, HILIC and PGC in respect to fluorescence labeled glycans are compared. The retention times of a set of glycans covering high-mannose and complex type glycans were determined in all chromatography modes and subsequently compared. Furthermore the retention times were correlated to the respective monosaccharide composition by multiple linear regression (MLR). In contrast to RPC and HILIC no adequate model could be found for PGC, which indicates that retention of oligosaccharides in PGC chromatography is not determined by the monosaccharide composition.

Autor*innen

Michael Melmer

Haupttitel (Englisch)

Investigation of high-performance liquid chromatography methods for the analysis of protein N-glycans

Paralleltitel (Deutsch)

Untersuchung von Hochleistungs-Flüssigchromatographie-Methoden zur Analyse von Protein N-Glykanen

Publikationsjahr

2010

Umfangsangabe

100 S. : graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Andreas Rizzi ,

Christian Huber

Klassifikation

35 Chemie > 35.29 Chromatographische Analyse, Elektrophorese

AC Nummer

AC08210461

Utheses ID

9500

Studienkennzahl

UA | 091 | 419 | |

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