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Characterization of an interaction partner of Density Enhanced Phosphatase (DEP-1)

Patricia Caroline Heier

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Bernd Binder

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DOI

10.25365/thesis.10520

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29640.36698.396764-1

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Density Enhanced Phosphatase 1 (DEP-1) spielt eine wichtige Rolle in der Regulation von Zellwachstum, Differenzierung und Transformation. Es wurde gezeigt, dass DEP-1 in verschiedenen humanen Tumoren mutiert ist. DEP-1 wurde zusätzlich als Tumorsuppressor-Gen beschrieben. Das Protein inhibiert MAP-Kinasen und hat daher einen antiproliferativen Effekt. In Knock-out-Mäusen konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von DEP-1 von fundamentaler Wichtigkeit für die Entwicklung des Gefäßsystems ist. In dieser Studie wollten wir einen potentiellen Interaktionspartner von DEP-1 charakterisieren, der zuvor durch einen Yeast-Two-Hybrid (Y2H) screen identifiziert worden ist, Hepatitis B Core-Antigen Binding Protein (HBCBP). Konfokale Mikroskopie zeigte, dass HBCBP ein cytoplasmatisch lokalisiertes Protein ist. Wir konnten zeigen, dass Überexpression von HBCBP, aber nicht von gekürzten HBCBP-Konstrukten, die Aktivität des ERK1/2 MAP-Kinase-Signalweges in Elk-1 Reporterassays signifikant gehemmt hat. Dies war auf die Inhibition in konfluenten Zellen beschränkt, während der Signalweg in subkonfluenten Zellen nicht gehemmt wurde. Im humanen System konnte eine Interaktion zwischen HBCBP und DEP-1 nicht durch Co-Immunoprezipitation bestätigt werden. Zusätzlich fanden wir, dass die Inhibierung des ERK1/2 MAP-Kinase-Signalweges durch HBCBP von DEP-1 unabhängig war und dass ebenfalls die Inhibierung durch DEP-1 von HBCBP unabhängig war. In Western-Bots war in HBCBP-überexprimierenden Zellen die Menge von phosphoryliertem ERK1/2 reduziert, jedoch nicht statistisch signifikant. HBCBP interagierte nicht direkt mit ERK1/2 und wir konnten auch keinen Interaktionspartner von HBCBP finden, der diesen Effekt vermittelte. Proliferations- und Apoptosestudien zeigten, dass HBCBP darauf keinen Einfluss hatte. Die Expression von HBCBP war nicht organspezifisch, aber konnte eine Hochregulierung der HBCBP-Expression in HUVECs durch TGFβ1 und IFNγ festgestellt werden, jedoch nicht in einem signifikanten Ausmaß. Wir benutzten unterschiedliche Softwareprogramme für die Analyse der Proteinsequenz von HBCBP, um Information über konservierte Domänen, evolutionare Verwandtschaft, homologe Regionen und Phosphorylierungsstellen zu bekommen, aber , aber auch diese lieferten keine Hinweise auf die Funktion von HBCBP. Interessanterweise ließ eine ClustalW2-Analyse vermuten, dass HBCBP nur im Chimpansen wiederzufinden ist, es gibt keine eng verwandten Gene im Menschen. Der Versuch, rekombinantes HBCBP für spätere Antikörperproduktion zu exprimieren und zu reiningen, wurde durch das ausschließliche Vorkommen in Inclusion-Bodies interkariert. Zusammenfassend haben wir gefunden, dass HBCBP mit DEP-1 nicht in einem detektierbarem Ausmass interagierte. Obwohl wir eine Inhibierung des ERK1/2-Signalweges durch HBCBP in Reporterassays fanden, was durch si-RNA-Analysen bestätigt wurden, konnten wir keine Auswirkungen auf Apoptose oder Proliferation feststellen, was die Möglichkeit offen lässt, dass HBCBP andere ERK1/2-abhängige Prozesse beeinflusst.

Abstract

(Englisch)

Density Enhanced Phosphatase 1 (DEP-1) plays an important role in the regulation of cell growth, differentiation and transformation. DEP-1 was shown to be frequently lost in mammary, lung and colon tumors and in addition, the gene has been described as tumor suppressor gene. The protein is known for its antiproliferative effect due to the inhibition of MAP-Kinases. A knock-out mouse model demonstrated that DEP-1 is of fundamental importance for the vascular development. In the present study, we wanted to characterize a potential interaction partner that was identified before in my diploma thesis by a yeast-two-hybrid (Y2H) screen, Hepatitis B Core-Antigen Binding Protein (HBCBP). According to confocal microscopy data, the protein is a cytoplasmic protein. We could show that overexpression of full-length HBCBP significantly downregulated the activity of the ERK1/2 MAP-Kinase pathway in Elk-1 reporter assays, while truncated HBCBP did not. Furthermore, this inhibition could only be shown in dense cells, while in samples with sparse cells this activity was absent. Unfortunately we could not confirm the interaction between HBCBP and DEP-1 in the human system by co-immunoprecipitation. In addition, we found that the inhibition of the ERK1/2 MAP-Kinase pathway by HBCBP does not require the presence of DEP-1 and that similarly the inhibition by DEP-1 does not require the presence of HBCBP. In western blots the amount of phosphorylated ERK1/2 was reduced in cells overexpressing HBCBP, though not in a statistically significant way. HBCBP did not interact with ERK1/2 directly and we could not find another interaction partner of HBCBP that medited the effect. To see, if HBCBP has a quantifiable effect on ERK1/2 MAP-Kinase dependent processes, we used proliferation and apoptosis studies showing that HBCBP had no influence. Searching for hints, in which processes HBCBP could be involved, we found the HBCBP expression to not be organ-specific, but detected an upregulation of HBCBP expression upon TGFβ1 and IFNγ treatment in HUVECs, though not significant. We used different software programs to analyze the protein sequence of HBCBP to get information about conserved domain patterns, evolutionaly relationships, homologous regions and phosphorylation sites, but none of these approaches could give us promising results. Interestingly a ClustalW2 analysis indicated an HBCBP-orthologue in chimpanzee, but there are no related genes in human. Also our last attempt to express and purify recombinant HBCBP for later antibody production was confronted with severe limiting difficulties. Taken together, we found that HBCBP does not interact with DEP-1 in a detectable way. Although we found an inhibition of the ERK1/2 pathway in reporter assays by HBCPB that were confirmed by siRNA analyses, this signaling pathway did not involve apoptosis or proliferation, leaving the option that HBCBP influences other ERK1/2 dependent processes.

Autor*innen

Patricia Caroline Heier

Haupttitel (Englisch)

Characterization of an interaction partner of Density Enhanced Phosphatase (DEP-1)

Paralleltitel (Deutsch)

Charakterisierung eines Interaktionspartners von Density Enhanced Phosphatase 1 (DEP-1)

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

110 S. : Ill., graf. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Pavel Kovarik ,

Alan So

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC05037590

Utheses ID

9501

Studienkennzahl

UA | 091 | 442 | |

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