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Selective translation of leaderless mRNAs under different stress conditions

Sanda Pasc

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Isabella Moll

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DOI

10.25365/thesis.10566

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29396.28068.964765-8

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Bei der Infektion eines Wirtes werden Bakterien Änderungen in ihrer Umgebung ausgesetzt, wie z.B. Abweichungen der Temperatur und pH-Werte, Mangel an Nährstoffen oder Magnesium sowie die Behandlung mit Antibiotika. Darum haben sie unterschiedliche Mechanismen zur Regulation der Genexpression entwickelt, um eine schnelle Anpassung an die gegebenen Bedingungen zu ermöglichen. Vor kurzem wurde gezeigt, dass die Behandlung von Escherichia coli mit dem Aminoglykosid-Antibiotikum Kasugamycin zur Bildung von protein-defizienten Ribosomen führt. Diese ribosomalen Partikel translatieren selektiv sogenannte „leaderless“ mRNAs, welche mit einem 5‘-terminalen AUG Startkodon beginnen und daher keine weiteren Translationsinitiationssignale aufweisen. Weitere Studien deuten darauf hin, dass die Ausbildung einer Proteinsynthesemaschinerie, die selektiv für „leaderless“ mRNAs ist, einen neuartigen Mechanismus in der Stressantwort von Bakterien representieren könnte. Daher war ein Ziel dieser Arbeit verschiedene Stressbedingungen auf eine selektive oder stimulierte Synthese von „leaderless“ mRNAs zu testen, um Bedingungen zu identifizieren die das Proteinkomplement von Ribosomen beeinflussen. Zu diesem Zweck habe ich ein „leaderless“ gfp-basiertes Reportersystem getestet, welches die einfache Untersuchung von unterschiedlichen Bedingungen ermöglicht. Um einen direkten Vergleich zwischen der Translation von „leaderless“ und kanonischen mRNAs zu ermöglichen, habe ich darüber hinaus ein bicistronisches Transkript konstruiert, das eine „leaderless“ gfp und eine kanonische yfp mRNA beinhaltet. Die Anwendbarkeit von diesem Konstrukt wurde in dieser Studie überprüft, indem unterschiedliche Stressbedingungen angewendet wurden. Die Änderung des Transkriptionsprogramms stellt einen allgemeinen Mechanismus für eine Stressantwort in Bakterien dar. Die Schlüsselmoleküle für die Stimulierung der alternativen Transkription sind Guanosintetra- und pentaphosphat, (p)ppGpp, welche bei Nährstoffmangel durch die Aktivität zweier Enzyme, RelA und SpoT, in einem als „stringente Kontrolle“ bezeichneten Mechanismus schnell angereichert werden. Aktuelle Studien im Labor weisen auf die Bildung von „leaderless“ mRNAs durch alternative Transkription nach Behandlung mit Kasugamycin hin. Daher wäre es denkbar, dass Bedingungen, welche die Ausbildung von „leaderless“ mRNAs induzieren, sich auch auf die Ribosomen auswirken könnten und diese selektiv für „leaderless“ mRNAs machen. Da (p)ppGpp die Transkription unter Stressbedingungen moduliert, war das zweite Ziel dieser Arbeit zu testen, ob (p)ppGpp die Translation von „leaderless“ mRNAs stimulieren könnte. Mit Hilfe von „Pulse-labeling“ Analysen, konnte ich diese Hypothese bestätigen. Weitere Studien weisen auch auf einen Einfluss der Endonuklease MazF, welche einen Teil des Toxin-Antitoxin Systems mazEF darstellt, auf die Bildung von „leaderless“ mRNAs durch einen mRNA-abbauenden Mechanismus hin. Da dieses Toxin-Antitoxin System auch durch erhöhte Konzentration von (p)ppGpp aktiviert werden kann, habe ich den Effekt der Überexpression von mazF auf die Translation einer „leaderless“ Reporter-mRNA untersucht. Die Ergebnisse der „Pulse-labeling“ Experimente zeigten, dass Überexpression von mazF gleichzeitig die Ausbildung von „leaderless“ mRNAs und die Proteinsynthesemaschinerie beeinflusst und weiters zu selektiver Translation dieser speziellen Klasse von mRNAs führt. Diese Beobachtung unterstützt die Hypothese, dass das Toxin-Antitoxin System durch eine erhöhte Konzentration an (p)ppGpp unter Stressbedingungen aktiviert wird und die aktive MazF Endonuklease die Selektivität des Ribosoms beeinflussen könnte. Somit könnte unter Stress MazF sowohl zur Bildung von „leaderless“ mRNAs als auch zur Modifikation von Ribosomen führen. Die resultierende selektive Translation könnte wesentlich für das Überleben von Bakterien unter ungünstigen Bedingungen sein. Zusammengefasst, weisen diese Ergebnisse auf einen neuen Mechanismus in der Stressantwort hin, der es Bakterien ermöglicht, rasch auf sich ändernde Bedingungen zu reagieren.

Abstract

(Englisch)

Upon infection of a host, bacteria experience changes in their environmental conditions, like variation of temperature and pH, nutrient or magnesium depletion as well as antibiotic treatment. Therefore they have evolved different mechanisms to modulate gene expression to allow fast adaptation to given conditions. Recently, it was shown that treatment of Escherichia coli with the aminoglycoside antibiotic kasugamycin results in the formation of protein-depleted ribosomes. These particles selectively translate leaderless mRNAs, which contain a 5’-terminal AUG start codon and therefore lack other ribosome recruitment signals. Several lines of evidence indicate that the formation of a protein synthesis machinery, which is selective for leaderless mRNAs, might represent a novel stress response mechanism in bacteria. Therefore, one aim of this study was to determine conditions, which lead to selective or stimulated synthesis of leaderless mRNAs as a means to identify conditions affecting the protein complement of the ribosome. For this purpose, I tested a leaderless gfp-based reporter system, which would facilitate the screening of a variety of conditions. Moreover, to allow a direct comparison between leaderless and canonical mRNA translation, I constructed a bicistronic transcript, harbouring a leaderless gfp and a canonical yfp mRNA. The applicability of these constructs was validated in this study, employing different stress conditions. The alteration of the transcriptional program represents a common mechanism for the stress response. The key molecules for the stimulation of alternative transcription are the guanosine tetra- and pentaphosphates (p)ppGpp, which accumulate fast upon nutritional stress by the activity of two enzymes, denominated RelA and SpoT, in a mechanism termed “stringent response”. Recent studies performed in the laboratory provide evidence for the accumulation of leaderless transcripts by alternative transcription upon kasugamycin treatment. Therefore, it was tempting to speculate that conditions, which induce the formation of leaderless mRNAs, might as well affect the protein synthesis machinery, making it selective for the leaderless mRNAs. As (p)ppGpp modulates transcription under stress conditions, the second aim of this study was to test whether (p)ppGpp is required for stimulation of leaderless mRNA translation. Employing pulse labeling assays, I was able to verify this hypothesis. Furthermore, several results indicate that the endonuclease MazF, which is part of the toxin-antitoxin system mazEF, is partially responsible for the formation of leaderless mRNAs via an mRNA processing mechanism. Since this toxin-antitoxin system can be triggered by increased levels of (p)ppGpp, I studied the effect of mazF overexpression on translation of a leaderless reporter mRNA. The results of the pulse labeling experiments revealed that overexpression of mazF concomitantly to formation of leaderless mRNAs affects the protein synthesis machinery and results in selective translation of this special class of mRNAs. This observation strongly supports the notion that under stress conditions the toxin-antitoxin system could be induced by increased levels of (p)ppGpp and consequently, the active MazF endonuclease might affect the selectivity of the ribosome. Taken together, the formation of the leaderless mRNAs, which are selectively translated by modified ribosomes upon activation of MazF under stress could lead to the expression of genes, which are substantial for survival of bacteria under adverse conditions. Therefore, these observations point towards a novel post-transcriptional stress adaptation mechanism in bacteria to modulate gene expression.

Autor*innen

Sanda Pasc

Haupttitel (Englisch)

Selective translation of leaderless mRNAs under different stress conditions

Paralleltitel (Deutsch)

Selektive Translation von "leaderless" mRNAs unter verschiedenen Stressbedingungen

Publikationsjahr

2010

Umfangsangabe

93 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Isabella Moll

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC08279810

Utheses ID

9541

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

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