Detailansicht
A proteomic study on off-target effects of therapeutic oligonucleotides
Martina Stessl
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Christian Noe
DOI
10.25365/thesis.10604
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30046.31243.458265-7
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Ein Schwerpunkt der modernen pharmazeutischen Forschung liegt in der Erforschung sicherer und effizienter Methoden zur Hemmung bestimmter Gene im menschlichen Körper, die mit schwerwiegenden Krankheiten in Verbindung gebracht werden. In diesem Zusammenhang haben sogenannte „gene-silencing“ Therapeutika, also Substanzen, die spezifische Gensequenzen blockieren können, wie zum Beispiel Antisense-Oligonukleotide (ASOs) oder kleine hemmende RNA-Strukturen (siRNAs), großes Potential als potentielle neue Wirkstoffe. Trotz vielversprechender Ansätze und bisher einer Substanz dieser Klasse auf dem Markt, ist die erfolgreiche klinische Entwicklung dieser Therapeutika noch mit zahlreichen offenen Fragestellungen behaftet, wie etwa hinsichtlich der Stabilität, der Aufnahme in die entsprechenden kranken Zellen sowie unspezifischer Effekte mancher Substanzen. Die meisten Antisense-Oligonukleotide, die in höheren klinischen Studien getestet werden, gehören zur Gruppe der Phosphorthioate, wie zum Beispiel Oblimersen (Genasense, G3139), das gegen verschiedene Tumorarten, unter anderem gegen Melanome, getestet wird. Dieses 18 Basenpaar lange Oligonukleotid hemmt spezifisch ein Protein namens Bcl-2, das eine Schlüsselfunktion in der mitochondrialen Apoptose, also im programmierten Zelltod, spielt. Der genaue Wirkmechanismus von Oblimersen ist noch nicht völlig geklärt. Es wird aber davon ausgegangen, dass die Bcl-2 Hemmung nicht der einzige Mechanismus ist, mit dem Oblimersen eine (Re-)Sensibilisierung von Melanomzellen gegenüber Chemotherapie erreicht [Stein et al., 2009]. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, potentielle unspezifische Effekte am Proteom von Melanomzellen, verursacht durch Oblimersen und durch eine ebenfalls gegen Bcl-2 gerichtete siRNA, mit Hilfe einer validierten Proteomuntersuchung dar zu stellen und zu vergleichen. Benötigte ASOs und siRNAs wurden synthetisiert. Anschließend wurde die humane Melanomzelllinie 607B, die das anti-apoptotische Zielprotein Bcl-2 über-exprimiert, damit transfiziert. Obwohl beide Sequenzen das Zielprotein effektiv herunter regulierten, konnte nach 48 Stunden Transfektion nur bei Oblimersen-behandelten Zellen eine Apoptoseinduktion festgestellt werden. Basierend auf derselben 75 prozentigen Bcl-2 Hemmung, wurden die unterschiedlich behandelten Zelllysate mittels zwei-dimensionaler Gelelektrophorese und anschließender Software-gestützter Bildanalyse untersucht. Dazu mußten im Vorfeld verschiedene Parameter, unter anderem die Auftrennungs- und Färbebedingungen, optimiert und die bioanalytischen Methoden validiert werden. Da die verwendete Zelllinie auf Proteinebene noch nicht charakterisiert worden war, wurde eine Referenzkarte des Proteommusters erstellt. Mit Hilfe der DIGE Technologie konnte eine Beeinflussung der Genexpression von 22 Proteinen nach der Behandlung mit Oblimersen und von 2 Proteinen nach der Behandlung mit der siRNA festgestellt werden. Dies deutet darauf hin, dass die verwendete siRNA target-spezifischer wirkt als das Phosphorthioat. Die in ihrer Expression beeinflußten Proteine wurden im Anschluß mittels „in-gel“ Verdau und MALDI-rTOF-MS eindeutig identifiziert. Unter ihnen befanden sich Zytoskelett-Proteine, Chaperone, Transportproteine, glykolytische und andere Enzyme, Proteine, die in die Ca2+-Regulierung oder in die Redox-Regulierung der Zelle involviert waren, und auch andere Proteine, wie zum Beispiel Galectin-1. Viele dieser Proteine stehen mit Apoptose oder Therapie-Resistenzentwicklung in Verbindung. Das interessanteste Ergebnis der Studie war jedoch die beobachtete Expressionsreduktion glykolytischer Enzyme nach der Behandlung mit Oblimersen, welche auf eine teilweise Umkehr des sogenannten Warburg Effekts hinwies [Warburg et al., 1930]. In derselben Proteomuntersuchung wurden ähnliche Ergebnisse mit Phosphorthioat-modifizierten Kontrollsequenzen erreicht, die gegen andere, nicht mit Apoptose in Zusammenhang stehende, Gene gerichtet waren. Die präsentierten Ergebnisse unterstützen die Theorie, dass die bekannte Bcl-2 Reduktion nicht der einzige essentielle Wirkungsmechanismus von Oblimersen ist. Eine unspezifische Apoptoseinduktion, die wahrscheinlich durch eine Blockade des VDAC-Proteins („voltage-dependent anion channel“) [Stein et al., 2008] durch das Phosphorthioat verursacht wird, dürfte eine weitere entscheidende Rolle spielen. Da die erwähnte teilweise Umkehr des Warburg Effektes auch mit den Kontrolloligonukleotiden beobachtet wurde, ist es sehr wahrscheinlich, dass diese durch die Phosphorthioatmodifikation und nicht nur durch die Bcl-2 Hemmung verursacht wird.
Abstract
(Englisch)
One focus of modern pharmaceutical research is the investigation of safe and efficacious ways of specifically silencing important targets that have been identified to play key roles in severe diseases. In this context gene silencing approaches, including antisense oligonucleotides (ASOs) and small interfering RNAs (siRNAs), have great potential as therapeutics. Despite this promising concept and the success of so far one approved product, the clinical development of antisense agents is challenged with issues regarding site-specific delivery, stability and off-target effects. Most antisense agents in late-stage clinical development belong to the group of phosphorothioates, such as Oblimersen (Genasense, G3139). The 18mer phosphorothioate is directed against Bcl-2, a key protein of the mitochondrial apoptotic pathway, and is clinically tested against a variety of different cancers including melanoma. The working mechanism of Oblimersen is poorly understood, since Bcl-2 silencing is supposed not to be the sole mechanism for chemosensitization in melanoma cells [Stein et al., 2009].
The aim of this work was the establishment of a validated proteomic approach in order to monitor and compare potential off-target effects of the phosphorothioate Oblimersen and a bcl-2-targeted siRNA on the protein level. Required ASOs and siRNAs were synthesized and transfected to the human melanoma cell line 607B, which over-expressed the anti-apoptotic target protein Bcl-2. Although both sequences successfully down-regulated Bcl-2, only Oblimersen induced apoptosis in 607B cells after 48 hours of transfection as determined by annexin staining and caspase assay. Based on an equal target down-regulation of 75%, differently treated cell lysates were investigated by two-dimensional gel electrophoresis and subsequent software-based image analysis. Therefore optimization of two-dimensional separation and staining conditions, as well as the validation of bioanalytical methods had to be performed in order to obtain reliable quantitative proteomic data. Since the used cell line had not been characterized on the protein level before, a protein reference map was established. The differential expression of 22 proteins after Oblimersen-treatment and of 2 proteins after siRNA-treatment, monitored by DIGE technology, suggested a higher target specificity for the used siRNA compared to the tested phosphorothioate. Changed proteins, which were unambiguously identified by in-gel digestion and subsequent MALDI-rTOF-MS, included cytoskeletal proteins, chaperons, transport proteins, glycolytic and other enzymes, proteins involved in Ca2+-signaling and in redox-regulation as well as other proteins, such as galectin-1. Many of these proteins are linked to apoptosis or drug resistance. The most interesting result, however, was the observed reduction in the expression of glycolytic enzymes after Oblimersen treatment, indicating a partial reversal of the Warburg effect [Warburg et al., 1930]. Using the same proteomic approach similar effects were obtained with control phosphorothioate-modified oligonucleotides targeted at genes not involved in apoptosis. Presented findings support the theory that the Bcl-2 reduction is not the only essential molecular effect of Oblimersen. An unspecific apoptosis induction, possibly caused by a blockage of the voltage-dependent anion channel (VDAC) [Stein et al., 2008] by the phosphorothioate, seems to play a further key role. Since the discussed partial reversal of the Warburg effect has been observed also with control sequences, it seems to be caused by the phosphorothioate chemistry and not exclusively by bcl-2 targeted gene silencing.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Oblimersen phosphorothioate siRNA apoptosis glycolysis proteomics
Schlagwörter
(Deutsch)
Oblimersen Phosphorthioat siRNA Apoptose Glykolyse Proteomik
Autor*innen
Martina Stessl
Haupttitel (Englisch)
A proteomic study on off-target effects of therapeutic oligonucleotides
Paralleltitel (Deutsch)
Untersuchung von "off-target" Effekten therapeutischer Oligonukleotide auf Proteomebene
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
184 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Uwe Zangemeister-Wittke ,
Andreas Rizzi
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften
AC Nummer
AC08262728
Utheses ID
9576
Studienkennzahl
UA | 091 | 449 | |