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Analysis of plasmid isoforms and supercoiled topoisomers by liquid chromatography
Marek Mahut
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Michael Lämmerhofer
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29901.03760.992570-8
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Im Rahmen meiner Dissertation wurden verschiedene Formen von Plasmid-DNA
mit chromatographischen Methoden getrennt. Die Arbeit wurde in zwei Bereiche
geteilt, wobei sich der erste mit der Trennung von Isoformen befasste, wie
superspiralisierte, offen-zirkuläre und lineare Plasmid-DNA. Der zweite Teil
behandelt die Trennung und Identifizierung von topologisch unterschiedlichen
Formen von superspiralisierten Plasmiden, solchen mit unterschiedlichem Grad an
Superspiralisierung. Dazu wurden in erster Linie neue Trennmaterialien auf Basis
von Kieselgelen entwickelt und getestet, um Struktur-Trennbeziehungen zwischen
Ligand und Analyt zu bestimmen. Dabei stand die Entwicklung von neuen
molekularen Erkennungsprinzipien im Vordergrund, um definiertes und robustes
Trennverhalten zu erzielen.
Im ersten Bereich der Trennung von Isoformen wurden diverse Liganden sowie
chromatographische Träger getestet, wobei sich erst eine optimale Kombination
aus beiden als zielführend erwies. So zeigte eine Kieselgeloberfläche mit sauren
Silanolgruppen in Kombination mit einem kurzen Spacer zwischen Träger und
Ligand eine vollständige Wiederfindung von allen zu quantifizierenden
Analytformen, welche dem heutzutage standardmäßig eingesetzten
kommerziellen Material überlegen ist. Ebenso konnte gezeigt werden, dass
Trennungen auf Basis von molekularer Erkennung ein definiertes
Elutionsverhalten zeigen, welches von den chromatographischen Bedingungen
unbeeinflusst ist.
In der vorliegenden Arbeit wird erstmals eine analytisch nützliche
chromatographische Trennung von unterschiedlichen Topoisomeren der nativen
superspiralisierten Form gezeigt. Bis zu diesem Zeitpunkt war eine topologische
Analyse von Plasmid-DNA nur mit der Gelelektrophorese möglich, und dies mit
der Einschränkung, dass nicht native Plasmide sondern nur Moleküle mit geringer
Superspiralisierung analysiert werden konnten. Hierfür wurde ein
chromatographischer Ligand gefunden, der aufgrund der definierten räumlichen
Anordnung von Wasserstoffbrücken-Donoren und -Akzeptoren und hoher Rigidität
verschieden superspiralisierte DNA erkennt. Mit Hilfe von Agarosegel-
Elektrophorese wurde die Zahl der superhelikalen Windungen bestimmt. Da die
Chromatographie im Gegensatz zu elektrophoretischen Techniken leichter
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skalierbar ist, öffnen sich hiermit Möglichkeiten zur Herstellung von definierten
topologischen Standards für analytische und biologische Zwecke.
Abstract
(Englisch)
In this thesis a separation of different forms of plasmid DNA by means of
chromatographic methods is presented. The work was split into two general
objectives, the first dealing with separation of plasmid isoforms, such as the
supercoiled, open-circular and linear plasmid DNA. The second general topic
deals with the separation of topologically different forms of supercoiled plasmids,
such with a different degree of supercoiling. New silica-based materials were
developed and tested in this study, to determine structure-separation relationships
between the chromatographic ligand and the analyte. In doing so, we focused on
the development of new molecular recognition principles in order to obtain a
defined and robust separation behaviour.
Within the first general objective of the isoform separation, various ligands and
chromatographic supports were tested, during the course of which an optimal
interplay of both in combination with specific mobile phase conditions lead to
desired results. A silica gel surface containing acidic silanol groups in combination
with a short spacer between the support and the chromatographic ligand showed
complete recoveries of all analyte forms to be quantified, outperforming the
commercial material that is currently employed for this purpose. It was also shown,
that separation based on molecular recognition gives a defined elution behaviour
being unaffected by chromatographic conditions.
In the presented work an analytically useful chromatographic separation of
different topoisomers of native supercoiled plasmid DNA is presented for the first
time. Up to now a topology analysis was only possible with gel electrophoresis
with the restriction that not native plasmid DNA but only molecules with a small
degree of supercoiling could be analyzed. The key element of the presented
method is a chromatographic ligand, which recognizes differently supercoiled
plasmid DNA because of high rigidity and a defined geometric arrangement of
hydrogen bonding donor and acceptors. We have determined the number of
superhelical turns by means of agarose gel electrophoresis. Since
chromatography in general allows easier up-scaling compared to electrophoretic
methods, new possibilities of producing topological standards arise, both for
analytical and biological purposes.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
plasmid DNA topoisomer isoform chromatography molecular recognition
Schlagwörter
(Deutsch)
Plasmid DNA Topoisomer Isoform Chromatographie molekulare Erkennung
Autor*innen
Marek Mahut
Haupttitel (Englisch)
Analysis of plasmid isoforms and supercoiled topoisomers by liquid chromatography
Paralleltitel (Deutsch)
Analyse von Plasmidisoformen und superspiralisierten Topoisomeren mit Flüssigkeitschromatographie
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
122 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Margit Cichna-Markl ,
Rainer Hahn
AC Nummer
AC08301255
Utheses ID
9594
Studienkennzahl
UA | 091 | 419 | |