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Enhanced analysis of peptides with multiple phosphorylated amino acids and nitrogen-bound protein phosphorylations by titanium dioxide enrichment and mass spectrometry
Andreas Schmidt
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Gustav Ammerer
DOI
10.25365/thesis.10829
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30203.67379.979966-2
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
In Zellen gibt es unzählige, chemische Prozesse, wie z.B. Zellteilung oder Wachstum, welche ausschließlich von Proteinen gesteuert werden und strikter Regulierung bedürfen. Einen sehr wichtigen Beitrag zur Regulierung von Proteinaktivitäten liefern post-translationale Modifikationen, welche in Form von reversiblen, an Aminosäureseitenketten gekoppelte Molekülen, wie bei der Acetylierung oder Phosphorylierung, oder als irreversible Änderungen auftreten können, z.B. bei der Abspaltung eines Signalpeptids. Die Protein-Phosphorylierung stellt zum jetzigen Zeitpunkt die am besten untersuchte post-translationale Modifikation dar und spielt eine sehr wichtige Rolle für den Ablauf der Zellteilung sowie in fast allen Signaltransduktionswegen innerhalb der Zellen. Die Phosphorylierung wird von der Enzymfamilie der Proteinkinasen übertragen, welche einen Phospho-Ester an den Seitenketten der Aminosäuren Serin, Threonin, Tyrosin, ein Phospho-Anhydrid an Aspartat oder ein Phospho-Amidat an Stickstoff-Atomen von Histidin, Lysin oder Arginin synthetisieren. Dabei wird an vorher positiv geladenen oder ungeladenen Seitenketten eine negative Ladung angebracht, welche die Interaktion zu benachbarten Aminosäuren beeinflusst. Die Wichtigkeit dieser Modifikation für zelluläre Prozesse und die schwerwiegenden Effekte, die durch eine Missregulation entstehen, machen ein umfangreiches Verständnis dieser Modifikation erforderlich.
Durch Entwicklung neuer Methoden, die spezifisch auf die Anreicherung und Detektion post-translationaler Modifikationen ausgelegt sind, ist die Massenspektrometrie zu einer Standardmethode zum Nachweis von Proteinphosphorylierungen geworden. Aufgrund der Eigenschaften der verschiedenen phosphorylierten Aminosäuren müssen unterschiedliche experimentelle Bedingungen für die Bestimmung angewendet werden. Die Dissertation behandelt die Analyse von mehrfach phosphorylierten Peptiden und die Detektion von Stickstoff-gebundenen Phosphorylierungen in Peptiden in zwei Teilen. Im ersten Teil wird ein Protokoll vorgestellt mit dem Phosphorylierungsstellen in Peptiden besser identifiziert werden, wenn mehrere dieser Modifikationen in der Peptidsequenz vorhanden sind. Die Analyse von Stickstoff-gebundenen Phosphorylierungen ist im zweiten Teil detailliert beschrieben.
Peptide mit drei oder mehr Phosphorylierungen sind in den meisten Studien oft unterrepräsentiert, da sie einerseits nur zu einem geringen Prozentsatz vorhanden sind und andererseits aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften oft nicht detektiert werden. Zur Verbesserung der Analyse solcher vielfach phosphorylierter Peptide haben wir ein Protokoll entwickelt, welches Metalloxid-Affinitätschromatographie an Titandioxid mit der Sensitivität von Matrix-unterstützter Laser Desorption/Ionisations Massenspektrometrie verbindet. Dabei werden Phosphopeptide im ersten Schritt nach der enzymatischen Spaltung mittels Titanoxid angereichert. Aufgrund des ungenügenden Trennungsverhaltens vielfach phosphorylierter Peptide auf herkömmlichen "reversed phase" Chromatographiesäulen wurde die Elutionsmischung auf einer monolithischen Säule getrennt. Detektion und Identifikation erfolgt mittels Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisations-Massenspektrometrie, wobei aufgrund des besonderen Fragmentationsverhaltens der einfach geladenen Peptidionen oft eine hohe Sequenzabdeckung und genaue Lokalisation der Phosphorylierungsstelle erreicht werden kann. Als Modellsystem haben wir die mehrfach phosphorylierten Peptide von Osteopontin und ß-Casein analysiert und das neue Protokoll mit den etablierten Methoden "multi-stage activation" kollisionsaktivierter Dissoziation und Elektronentransferdissoziation verglichen.
Bereits in den frühen 1970er Jahren wurden Phosphorylierungen an Seitenketten von Histidin, Lysin oder Arginin beschrieben und mittels Radioaktivitätsassays nachgewiesen, allerdings sind nur sehr wenige Phosphorylierungstellen bekannt. Im Allgemeinen werden N-Phosphorylierungen mit der Domäne der Prokaryonten verbunden und gelten als evolutionär früheste Form der Protein-Phosphorylierung. Über die Funktion von Stickstoff-gebundenen Phosphorylierungen (N-Phosphorylierungen) auf Proteinen ist bisher nur wenig bekannt, da diese Modifikation durch die Probenvorbereitung oft verloren geht. Werden Bakterien Stress-Situationen ausgesetzt, wie z.B. erhöhter Temperatur oder hohen Salzkonzentrationen, müssen sie sich schnell an die Bedingungen anpassen und eventuelle Schäden, wie Proteinaggregation oder Denaturierung, beheben.
Aufgrund der Stickstoff-Phosphor-Bindung, welche signifikant reaktiver ist als die Sauerstoff-Phosphor-Bindung in den Phosphoestern von Serin oder Threonin, kann diese Modifikation sehr leicht unter sauren Bedingungen abgespalten werden. Daher wurde die Probenvorbereitung für die Analyse dieser Modifikation verändert um sie einer massenspektrometrischen Detektion zugänglich zu machen. Bei der Analyse solcher Verbindungen wird die Phosphorylierung als Phosphorsäure abgespalten, was oft zu Fehlinterpretationen führt. Um die Analyse von N-Phosphorylierungen zu verbessern, haben wir ein Anreicherungsprotokoll für die Metalloxid-Affinitätschromatographie sowie Trennbedingungen für die Umkehrphasen-Chromatographie optimiert. Das verbesserte Protokoll wurde im Folgenden zur Detektion der Phosphorylierungsstellen in verschiedenen bakteriellen Proteinen angewandt. Im Fall der Arginin-Phosphorylierung ist nicht nur die Probenvorbereitung von großer Wichtigkeit, sondern aufgrund des speziellen Fragmentationsverhaltens im Massenspektrometer wird auch die Interpretation der Daten erschwert. Um diese Modifikation zuverlässig von anderen Protein-Phosphorylierungen zu unterscheiden haben wir die Fragmentierung verschiedener Modellpeptide untersucht.
In dieser Dissertation werden zwei wichtige Probleme aktueller Phospho-Proteomstudien untersucht, die Analyse mehrfach phosphorylierter Peptide und die Eigenschaften von Arginin-gebundenen Proteinphosphorylierungen. Die Entdeckung der Arginin-Phosphorylierung lieferte aufschlussreiche Details zur Adaption von Bakterien an Stressbedingungen. Mit Hilfe einer optimierten Probenvorbereitung und Dateninterpretation kann eine Analyse Stickstoff-gebundener Proteinphosphorylierungen auch mit komplexen Proben wie Proteinkomplexen und Zell-Lysaten möglich werden.
Abstract
(Englisch)
One key principle of protein regulation is post-translational modification such as methylation or phosphorylation, which can alter activity, substrate interaction and subcellular localization of proteins. Protein phosphorylation is one of the key regulatory events driving cell growth and division, metabolism, and motility. Also many signal transduction processes require the activity of protein kinases and phosphatases. These enzymes catalyse the transfer of phosphate moieties from adenosine triphosphate as to specific amino acid side chains to form phosphoric acid esters, anhydrides, or phospho-amidates and thereby creating a negative charge at the amino acid side chain. Addition of the phospho-moiety requires physical interaction of kinase and target protein, which makes this modification an important marker for protein-protein interactions. Technical improvements of the sample preparation such as specific enrichment techniques as well as novel detection methods for mass spectrometry provide easier access to protein phosphorylation data and even allow quantitative analysis.
Physico-chemical properties of the different phospho-modifications on amino acids require different experimental strategies for detection by mass spectrometry. Therefore two strategies for phosphopeptide analysis are presented in individual sections of the thesis. The first part deals with the problem of peptides with multiple phosphorylations, which are quite often underrepresented in phospho-proteomic datasets. Furthermore, such peptides have often underlying combinatorial complexity, which is caused by the distribution of the phospho-moieties onto different putative acceptors. In the second section I report the first identification of a protein-arginine kinase as a fundamental signal transducer in bacteria. Further, I established a protocol which allows detection of this arginine modification by proteomic methods.
With regard to the first part, one of the problems for reliable detection of peptides with multiple phosphorylation sites by mass spectrometry is their low stoichiometry in comparison to unphosphorylated and singly phosphorylated peptides. Chemical properties which give rise to multiple charged isoforms, due to similar pKa values of the phospho-moieties, require specific separation conditions in chromatography and optimized mass spectrometric detection. Our protocol combines the previously reported titanium dioxide enrichment procedure with separation of phospho-peptides using a monolithic column followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Using this method, we are able to localize the phosphorylated amino acid in peptide sequences with 3 or more phospho-moieties reliably.
The second part of the thesis is focused on phosphorylation of histidines and arginines in peptides and proteins. Detection of this modification has been challenging because of its low stability under acidic conditions. Nevertheless, recently developed methods in mass spectrometry allow unambiguous identification of such phosphorylated amino acids. We developed a protocol which preserves the modification during sample preparation, thereby allowing us to detect arginine phosphorylation on a bacterial translation factor CtsR after in vitro phosphorylation with McsB. Using synthethic peptides we demonstrate the specificity of the arginine kinase McsB that is expressed in some Gram-positive bacteria.
Further, we optimized our protocol to purify arginine and histidine phosphorylated peptides from in vitro phosphorylation samples. Using these purified model peptides we monitored the hydrolysis at different temperatures and pH values, allowing us to estimate the limits of acidic treatment. To improve mass spectrometric detection, we applied different fragmentation conditions in collision-induced and electron-induced dissociation methods. Under collision-induced dissociation processes, the fragmentation behaviour of phospho-arginine containing peptides differs significantly from that of serine or threonine phosphorylated peptides, although all modifications show extensive elimination of phosphoric acid.
Based on the stability experiments, an enrichment procedure was established which allows purification of peptides with nitrogen-bound phosphorylations. Furthermore, we studied the influence of analysis method and search parameters on identification of the correct phospho-amino acid. This protocol confirmed the arginine phosphorylation of the bacterial protein CtsR and revealed a high similarity between the phosphorylation patterns of this protein from B. subtilis and B. stearothermophilus after in vitro phosphorylation. The developed protocol will also help to study these modifications in cell lysates of other bacteria and eukaryotic cells.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
phosphopeptide analysis mass spectrometry chromatography
Schlagwörter
(Deutsch)
Phosphopeptideanalyse Massenspektrometrie Chromatographie
Autor*innen
Andreas Schmidt
Haupttitel (Englisch)
Enhanced analysis of peptides with multiple phosphorylated amino acids and nitrogen-bound protein phosphorylations by titanium dioxide enrichment and mass spectrometry
Paralleltitel (Deutsch)
Analyse von Peptiden mit mehreren, phosphorylierten Aminosäuren und Stickstoff-gebundenen Phosphorylierungen mittels Titandioxid-Anreicherung und Massenspektrometrie
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
211 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Andreas Rizzi ,
Lukas Huber
AC Nummer
AC08340794
Utheses ID
9763
Studienkennzahl
UA | 091 | 419 | |