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Molekularbiologische Differenzierung und Identifizierung von Lactobacillus-Isolaten mit RAPD-PCR und PFGE

Cornelius Dürrer

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Helmut Mayer

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29332.33684.896766-2

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Laktobazillen finden als Starterkulturen bei der Produktion zahlreicher fermentierter tierischer- und pflanzlicher Lebensmittel, sowie bei der Konservierung von Viehfutter (Silage) mittels Milchsäuregärung Anwendung. Zudem existiert eine Vielzahl wissenschaftlicher Arbeiten, welche spezifischen, klinisch getesteten Milchsäurebakterienstämmen, die als Probiotika in der Human- bzw. Tierernährung zum Einsatz kommen, gesundheitsfördernde- bzw. leistungs- und wachstumsfördernde Wirkungen bestätigen. Da die gesundheitsrelevanten Effekte der unterschiedlichen Milchsäurebakterien allerdings stammabhängig stark variieren, und um allfällige gesundheitliche Risiken auszuschließen, ist die zuverlässige, exakte Identifizierung dieser Mikroorganismen auf Stammebene von besonderer Signifikanz. Im Rahmen dieser Diplomarbeit sollten verschiedene Stämme der Spezies Lactobacillus buchneri und Lactobacillus sakei sowohl innerhalb der Spezies differenziert, als auch auf Stammebene identifiziert werden. Zur molekularbiologischen Identifizierung und Differenzierung der Lactobacillus-Isolate wurden zwei DNA-Fingerprinting-Methoden, die Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-PCR, sowie die Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE), eingesetzt. Alle sechs Probestämme der Versuchsreihe 1(N), welche der Spezies Lb. buchneri angehörten, ließen sich mittels RAPD-PCR eindeutig von den Typstämmen differenzieren. Vier der Teststämme konnten jedoch aufgrund des identen DNA-Fingerprints nicht voneinander unterschieden werden. Die beiden Isolate A 100-1 und A 100-1* zeigten unter Anwendung einiger Primer ein individuelles – allerdings bei allen 55 Primern untereinander gleiches – Fingerprint-Muster, womit sich die zwei Isolate zwar von den übrigen vier Probestämmen abgrenzen ließen, eine Unterscheidung zwischen A 100-1 und A 100-1* allerdings nicht getroffen werden konnte. Der Vergleich der Versuchsreihe 1(N) mit 1(A) ergab unter Anwendung der RAPD-PCR, dass die jeweils gleich benannten Stämme beider Versuchsreihen exakt den selben DNA-Fingerprint besaßen. Diese Ergebnisse wurden durch Einsatz der PFGE nach Schneiden der DNA mit den vier Restriktionenzymen Sac II, Sal I, Sfi I und Xba I bestätigt. Die fünf Teststämme der Versuchsreihe 2, welche der Spezies Lb. sakei zugerechnet wurden, konnten durch Einsatz von zwölf verschiedenen Zufallsprimern nicht nur zweifelsfrei untereinander, sondern auch vom Typstamm Lb 92T, unterschieden werden. Mittels RAPD-PCR konnten 21 LAC 905-Probeisolate der Spezies Lb. buchneri (inklusive Referenzstamm LAC 905) vom Stamm A 100-1* und vom Typstamm Lb 32T unterschieden werden. Wurde jedoch noch unter Anwendung von 28 verschiedenen RAPD-Primern für alle 21 Isolate, sowie den Vergleichsstamm LAC 905, ein identischer DNA-Fingerprint bescheinigt, so zeigten sich bei der sensitiven PFGE die Vorteile gegenüber der RAPD-PCR: Die beiden Isolate LAC 905 10 und LAC 905 19 konnten mit Hilfe einiger Restriktionsenzyme, doch besonders durch Restriktion des Enzyms Sal I (mit anschließender PFGE bei einer Pulszeit von 6->2 sec.), durch ein jeweils individuelles Fingerprint-Muster nicht nur eindeutig untereinander – sondern auch von den restlichen Probeisolaten – differenziert werden. Die anspruchsvolle, arbeits- und kostenintensive, jedoch äußerst sensitive PFGE, welche als „Gold-Standard“ der DNA-Fingerprint-Verfahren angesehen wird, und eine exzellente Trennschärfe auf Stammebene besitzt, ergänzt die schnell durchführbare, kostengünstige, allerdings mäßig reproduzierbare, und weniger empfindliche RAPD-PCR-Technik, um nicht nur die Identität eines Mikroorganismus möglichst präzise zu bestimmen, sondern die Ergebnisse auch im Sinne eines sogenannten Mehrphasenansatzes, bei dem die Resultate mehrerer Methoden mit unterschiedlicher Aussagekraft und differenziertem, diskriminativen Potential kombiniert werden, abzusichern.

Abstract

(Englisch)

Lactobacilli are widely used as starter cultures in the production of numerous fermented animal and vegetable foods, and also for the preservation of cattle fodder (silage) by lactic acid fermentation. Moreover, there exists a multitude of papers dealing with specific clinically tested lactic acid bacteria strains, used as probiotics in human and animal nutrition, which confirm health-promoting, performance- and growth-enhancing effects. However, since the health effects of different lactic acid bacteria are greatly strain dependent, and for the avoidance of possible health hazards, reliable and accurate identification of these microorganisms at strain level is of particular significance. Within the scope of this diploma thesis, different strains of the species Lactobacillus buchneri and Lactobacillus sakei should be differentiated both within the species and identified at strain level. For molecular biological identification and differentiation of the Lactobacillus isolates, two DNA-fingerprinting-methods, the Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-PCR, and also the Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) were used. All six test strains of the test series 1(N) which belonged to the species Lb. buchneri could be clearly discriminated from the type strains applying RAPD-PCR. Four of the test strains could not be distinguished from each other due to their identical DNA-fingerprints. With the use of several primers, the two isolates A 100-1 and A 100-1* showed an individual DNA-fingerprint whereby this two isolates could be distinguished from the remaining four test strains; however, using all 55 primers, fingerprint-patterns among this two strains were equal, so they could not be differentiated from each other. Using RAPD-PCR, equally termed strains of the test series 1(N) and 1(A) showed exactly the same DNA-fingerprint. These results were confirmed by the application of PFGE after cutting the DNA with four restriction enzymes Sac II, Sal I, Sfi I and Xba I. By the use of twelve variant RAPD-primers, all five strains of the test series 2 which pertained to the species Lb. sakei could not only be discriminated doubtlessly among themselves but also from the type strain Lb 92T. Using RAPD-PCR, 21 LAC 905-test isolates (and the reference strain LAC 905) which belonged to the species Lb. buchneri could be differentiated from the strain A 100-1*, and from the type strain Lb 32T. By the use of 28 different RAPD-primers an identical DNA-fingerprint was confirmed for all 21 isolates and also for the reference strain LAC 905, but application of the more sensitive PFGE showed the advantages of this method in comparison to the RAPD-PCR: With the aid of several restriction enzymes (particularly cutting the DNA with restriction enzyme Sal I, followed by application of PFGE using 6->2 sec. as a suitable pulse time), the two isolates LAC 905 10 and LAC 905 19 could not only be discriminated clearly among each other, but also distinguished from the remaining isolates through a distinct fingerprint-pattern. The demanding, work- and cost-intensive, but highly sensitive PFGE exhibits excellent discriminatory power at strain level, and is considered to be the “gold standard” among the DNA-fingerprinting methods. It complements the expeditious, inexpensive, but moderate reproducible and less sensitive RAPD-PCR-technique not only to determine the identity of a microorganism as accurate as possible, but also to ensure the results within the meaning of a so-called polyphasic approach, whereby the findings of different methods featuring different significance and differing discriminative potential are combined.

Autor*innen

Cornelius Dürrer

Haupttitel (Deutsch)

Molekularbiologische Differenzierung und Identifizierung von Lactobacillus-Isolaten mit RAPD-PCR und PFGE

Paralleltitel (Englisch)

Molecular biological differentiation and identification of Lactobacillus isolates with RAPD-PCR and PFGE

Publikationsjahr

2010

Umfangsangabe

X, 189 S.

Sprache

Deutsch

Beurteiler*in

Helmut Mayer

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC08244853

Utheses ID

9772

Studienkennzahl

UA | 474 | | |

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